中國水產門戶網報道
    水產動物病理學研究開始于20世紀50年代，它是一門研究疾病發生、發展中機體的形態、機能和代謝等方面的變化及其規律的科學。W．E．里貝林和G．三垣完成了第一部較完善的水產動物病理學著作《魚類病理學》，對物理和化學的致病機理、腫瘤的病理學以及利用電鏡對損傷細胞和亞細胞水平的觀察等方面作了比較深入的研究[1]。此后隨著水產養殖業的發展，水產動物病理學進入了系統研究階段。研究領域也從淡水魚類擴展到海水魚類、甲殼類、軟體動物、兩棲類、爬行類、棘皮動物、哺乳動物以及觀賞魚等，研究手段已從顯微組織病理深入到亞顯微組織病理、組織化學、比較病理以及病理生理研究等。最近，隨著其他學科如分子生物學及免疫學學科的滲入，一些相關的技術逐漸在病理學研究得到廣泛應用。本文從水產動物病理學研究的對象，研究的方向，技術，診斷的方法等方面作一綜述。 

　　1 研究的內容

　　1.1 研究的對象

　病理學研究的對象很廣，從淡水魚類到海水魚類研究的都比較多。近年來，對名特優品種的研究也漸漸多了起來，對貝類病理的研究也比較多，如任素蓮(2002)[2]報道一種牛首科吸蟲幼蟲在文蛤體內寄生所引起的組織病理學變化；李霞等(2000)[3]對被帕金蟲孢子體感染的菲律賓蛤仔主要器官的組織病理學進行了觀察等。從疾病上說，寄生蟲引起的病理學研究也多了起來，只是真菌類疾病的研究相對來說少了一點。此外，因機械損傷、營養缺乏、環境因子等造成的病理研究更少，但國外做了一些工作。目前國內對人魚共患疾病的病理研究還沒有引起足夠的重視，如張永嘉(1990)[4]報道的尼羅羅非魚肝癌，在形態和生物學上與人類肝癌都有相似之處，但它們之間關系的研究還較少。國外研究較多的是鮭魚類，大菱鲆等。新的魚病還沒有進行及時的研究，如在美國加利福尼亞鮭科魚類身上發現的兩種可能屬于細小核糖核酸病毒引起的疾病，在蘇格蘭鮭魚中發現的由液態沙雷菌、游菌引起的細菌病等[6]。國外對病理的研究較為系統，Conroy,-D.A. (1987)[7]等描述了不同的組織病理學和血液病理學，Amlacher,-E.(1992)[8]編著《魚類病理學基本原理》，Roberts,-R.J(1979)[9]編著了《魚類病理學》等。

　　1.2 研究的方向

　　1.2.1 血液病理學

　　研究的對象比較廣，但內容都差不多。如李谷等(2000)[10]進行了轉Bt－基因抗蟲棉棉仁粉對鯉魚的營養試驗，在不同時期取血，測定血像、谷丙轉氨酶、尿毒酶及血紅細胞微核率等反映毒性效應的指標。陳福華等(1997)[11]研究了患病赤點石斑魚的血液病理學。邢維賢等(1996)[12]從紅細胞的形態，脆性和白細胞的比率以及血清電解質離子濃度和血清谷丙轉氨酶等多方面對鯉魚豎鱗病的血液病理改變進行了觀察和研究。李義等(1998)[13]對大口鯰出血病的血液病理進行了研究。吳垠等(1998)[14]對患暴發性流行病的中國對蝦進行了血液生理生化指標檢測。張元柱等(2000)[15]分別測定了患穿孔病的中華鱉血液的谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、球蛋白、鈉、氯等10項指標，揭示了中華鱉穿孔病的血液病理變化規律。崔青曼等(1998)[16]對患有腐皮病的中華鱉的血液病理進行了初步研究。

　　1.2.2 生化病理學

　　吳惠仙等(2002)[17]研究了酯酶(EST)，過氧化物酶(POD)，乳酸脫氫酶(LDH)和蘋果酸脫氫酶(MDH)同工酶在日本沼蝦中存在著組織和器官的特異性，患黑鰓病后酶帶發生顯著變化。蔡完其等(1996)[18]對羅氏沼蝦莫格球擬酵母病的生化病理進行了研究，發現病蝦肝臟超氧化物歧化酶活性顯著降低，酯酯活性變異范圍擴大。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術，方廖瓊等(1997)[19]研究了患細菌性敗血癥草魚，曾伯平等(1995)[20]研究了患出血病草魚肝臟、腎臟、心臟、鍶及血清的乳酸脫氫酶（ＬＤＨ）同工酶。邵健忠等(1993)[21]研究了三角帆蚌11種組織中16種同工酶系統的酶譜表型，組織分布，活性含量和遷移特征等。

　　1.2.3 組織病理學

　水產動物組織病理學是研究最多的內容，其中又以疾病引起的組織病理研究為多，本文不再敘述。

　　1.2.3.1藥物中毒引起

　華可鼎(1995)[22]描述了氯霉素、呋喃西林等6種藥物引起鰻魚急性中毒的組織病理變化，發現其變化基本相似，只是程度不同。汪開毓等(2002)[23]研究了鯉魚喹乙醇急性中毒的病理學。郭海山等(1990)[24]報道了硫酸銅慢性中毒能引起草魚鰓小片毛細血管擴張，充血等。硫酸鋅急性中毒引起白鏈和鯽魚肝細胞壞死，解體等。Meinelt,-Th等(1997)[25]等研究了水體中汞引起的魚組織病理變化。

　　1.2.3.4 機械損傷、營養缺乏、環境因子等引起

　劉忠等(2002)[26]研究了拉網、稱重、裝車、運輸等應激反應，以及水溫、溶氧等環境因子的突變引起的魚的病理變化。席峰等(2001)[27]認為脅迫可引起如紅細胞形態該變、吞噬細胞數量增加等一系列病理變化。王朝輝等(2001)[28]報道赤潮毒素引起魚類鰓組織損傷的組織病理學。

　　國外在這方面研究的非常多，如Schreck報道隨放養密度增大，銀大麻哈魚的白細胞比會降低。Chang等(1990)[29]發現新西蘭發生的異彎藻赤潮引起鮭魚鰓組織上皮細胞嚴重壞死。R. N. Morrison, B. F.等(2001)[30]等研究了大西洋鮭被給予左旋咪唑免疫增強劑或鰻弧菌疫苗后，負作用所引起的病理變化。J. W. Treasurer等(2000)[31]研究了不同水體養殖的大西洋鮭感染同一病原后引起病理的區別。Tacon,-A.G.J.等(1995)[32]研究了魚類營養缺乏和中毒的形態病理學。

　　2 研究技術

　　2.1 傳統的研究技術

　　病理學研究最普遍而又最可靠的方法，是以細胞學、組織學和組織化學的方法，對水產動物病變部位和健康機體的相同組織采用固定、切片，再經染色，顯微鏡觀察等，了解機體組織的病變特點。劉建雄等(2002)[33]用該法研究并首次報道了黃鱔(緣擬扁蛭)水蛭病的病理。趙萬鵬等(2001)[34]用此法研究了鱉腎臟的基本病理組織變化，并作了歸納、總結等。陳細法等(1996)[35]對電鏡固定液進行了改良，并使用新的包埋劑制備超薄切片，在電鏡下觀察了感染ＭＢＶ的肝胰腺上皮細胞的超微病理變化。Roberts,-R.J等研究了斑節對蝦黑鰓病的組織病理學。

　　2.2 染色

　　Lightner等(1993)發明了Giemsa染色涂片法用于對蝦HPV的檢測，只需2h，一臺光學顯微鏡及少量器材即可用于現場檢測。但鄭天倫等（2002）[36]認為傳統的H—E染色檢測WSSV，較為費時。黃捷等(1995)[37]用T—E染色對WSSV進行現場檢測，整個過程只需10min左右，操作簡單易行，染色效果好于Giemsa染色涂片法。

　　2.3 顯微鏡觀察

　　以前病理觀察，主要采用光學顯微鏡。1966年美國開始建立診斷電鏡實驗技術以來，應用電鏡觀察標本細胞及細胞間的微細結構，并做出相應的病理診斷，從而使對發病機理的探討及未分化腫瘤的確診進入了亞細胞水平。此外，電鏡已成為認識病毒形態結構，分類鑒別的有力工具。

　　黃燦華等(1997)[38]應用光鏡和電鏡技術比較研究了正常與發病中國對蝦7種組織細胞的病理變化，為弄清對蝦病毒引起的病癥及致病機理打下基礎。杜開和等(2002)[39]取患“白體病”羅氏沼蝦腹部的病變組織及其鰓、心肌、肝胰腺、生殖腺等器官和組織，經光鏡和電鏡制樣觀察，未發現病原體。雷質文等(2002)[40]光鏡和電鏡下觀察患白斑綜合征病毒（WSSV）克氏原螯蝦的組織切片。張建紅等(1996)[41]描述了一種電鏡診斷快速制樣的方法在對蝦病害檢測中的應用，該法大大縮短了常規制樣法所需時間。王文興等(1998)[42]光鏡和電鏡下研究了膠州灣養殖海灣扇貝消化盲囊內寄生的原核生物。劉英杰等(2002)[43]用電鏡在櫛孔扇貝體內發現一種球形病毒。姜明等(1995)[44]年電鏡檢測了患病真鯛腸上皮組織，在細胞內發現了一種新的病毒粒子及其發生基質。徐潤林等(1992)[45]在光鏡水平下研究了刺激隱核蟲寄生黃鰭鯛和真鯛后引起宿主組織病理學的變化。舒新華等(1999)[46]采用透射電鏡對患腐皮病的牛蛙的病理形態的不同病期的病變皮膚進行了觀察。Lee,-J.-S.等(2000)[47]用光鏡和電鏡對鲇魚表皮和真皮系統的亞顯微結構進行了研究。 

　　３ 診斷技術

　　診斷方法有有傳統的形態病理學、擴增和生物測定、微生物學和血清學方法等。鄭蓮等(2001)[48]認為早期診斷必須具有較高的靈敏度，快速早期微量檢測須借助于分子生物學技術及免疫學技術等，其中分子生物學技術集中在原位雜交及PCR技術上，免疫學技術主要有熒光免疫、酶聯免疫吸附等。

　　3.1 生物測定法

　　生物測定與形態病理學檢測方法一起成為傳統的診斷法。如利用某些宿主對蝦對病毒侵染易感的特點，將其作為指示蝦，可對對蝦病毒病進行檢測。Bell等(1987)[49]用帶病或有感病可能的對蝦組織勻漿后的上清液注射到指示蝦體內，觀察反應。如果被檢者帶有病毒，則可傳染指示蝦，在實驗2—3周將出現有關病癥。據此可對待檢樣蝦是否被病毒感染作出診斷。何建國等(1999)[50]利用生物檢測，PCR、組織病理和電鏡技術，發現消化道是斑節對蝦感染白斑綜合癥桿病毒的主要途徑。

　　3.２ DNA雜交

　　也叫原位雜交，研究始于1969年。此技術通過堿基配對，以一條DNA鏈為模板，在加入的單鏈DNA片段上加以標記(同位素、熒光素、酶、生物素等)作為探針，可檢出具有與探針互補的DNA。60年代末，開始在組織切片上進行雜交。DNA雜交的深入研究，有助于靈敏度的提高，操作方便，開發試劑盒具有廣闊前景。

　　自1992年對蝦細小病毒IHHNV基因探針問世以來，這項技術一直被用于對蝦病毒、立克次氏體狀細菌和微孢子蟲的診斷中。李新輝等(1997)[51]首先建立了鱖魚病毒病的分子生物學檢測技術，適用于對像鱖魚一樣還未能建立敏感細胞系的魚類病毒病的研究，可以檢測病毒在組織中的分布，對了解病毒在體內侵染組織、器官和擴散有一定意義。王吉橋等(2002)[52]對皮下及造血組織壞死病毒病(IHHNV)、桃拉癥(Taura syndrome)、白斑綜合癥(WSSV)等病原均采用非放射性的基因組探針，目前已研制出了NHP、某些弧菌（Vibrio spp）和微孢子蟲的傳統基因探針。黃燦華等(1999)[53]通過原位雜交技術驗證了感染對蝦ＷＳＳＶ的淡水克氏螯蝦和中華絨螯病體的組織病理與從中國對蝦中分離的WSSV相似或相同。Mari,-J.等(1992)[54]克隆IHHNV基因做成探針進行診斷。Aoki,-T. (1991)[55]發展了快速DNA探針雜交的診斷方法。

　　3.3 聚合酶鏈反應(PCR)

　　PCR是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法。用PCR擴增靶DNA已經廣泛應用于病害感染的檢測，與傳統的診斷方法相比，它具有靈敏性高、簡單、快速等特點。

　　目前，PCR技術已廣泛應用于對蝦病原的診斷。戰文斌等(2000)[56]研究采用Kimura引物，用PCR技術對不同生長期的中國對蝦進行了WSSV的檢測。Poulos B T. 等(1995) [57]克隆了MBV總長12.5kb的4條核酸片段，制作了4個核酸探針，使用效果較好，其中克隆了BMNV的2.2、2.5、3.0kb三片段，并制備了商品化的探針及PCR檢測試劑。

　　3.４ 免疫技術

　　免疫學技術在病理學上的應用使水產動物病理學在近十幾年中發生了突飛猛進的發展。應用較多的是熒光免疫法和酶聯免疫法。此外，黃印堯等(2002)[58]對人工養殖九孔鮑暴發急性病，建立了病毒瓊脂擴散診斷法。

　　3.4.1 血清學

　　血清學診斷已用于對蝦病原的診斷。但目前只有血淋巴凝固時間和血球數量變化可用于蝦病診斷。現已研制出幾種弧菌和病毒的單克隆(Mab)和多克隆(Pab)抗體來診斷對蝦病原，但還須解決ELISA中免疫球蛋白(IgM)Mab與正常組織成分的非特異性反應問題，以提高診斷的準確性。薛清剛等(1995)[59]用密度梯度離心純化的HPV顆粒免疫家兔制備特異性抗原血清，建立了一種反向間接血凝法診斷HPV感染，敏感度達ng/ml病毒蛋白的檢測水平。張呂平等(2000)[60]用光鏡觀察感染白斑桿狀病毒（WSBV）的斑節對蝦的血淋巴涂片，研究了血清的主要生化指標，首次提出了WSBV在宿主體內增殖的時間過程。法國以血清反應為基礎，對病毒性傳染的血清學進行了大量研究工作。丹麥針對病毒性出血性敗血病進行了血清學研究，英國針對傳染性胰臟壞死病進行了血清學研究。

　　3.4.2　熒光免疫

　　免疫熒光技術是利用熒光色素標記抗體與組織切片或細胞涂片中的相應抗原反應，結合形成抗原—標記抗體復合物，借助紫外光或藍紫光激發熒光色素，在顯微鏡下呈現特異性熒光反應，從而定位抗原的技術。Hamaguchi,-M. 等(1988)[61]用熒光抗體技術檢測了鯡魚血細胞表面隔膜免疫球蛋白。Sano等(1985)將熒光抗體(Fluorescent Antibody)技術用于BMNV的診斷。國內使用熒光免疫技術研究病理罕有報道。

　　3.4.3 免疫組織化學

　　免疫組織化學技術是利用抗原抗體反應在微觀世界原位地確定組織及細胞結構化學成分的，其特點是：定性可靠，定位準確，定量可能。

　　夏永娟等(2000)[62]首次探索利用免疫組織化學ABC法檢測鰻弧菌，并用組織學Ｈ.Ｅ.染色技術對鰻弧菌人工感染后的牙鲆肝組織及胃腸道進行了組織病理學及細菌的定位研究。黃燦華利用膠體金免疫標記技術對感染病蝦細胞質中出現的球狀病毒作定位標記。薛清剛用兔抗對蝦肝胰腺細小病毒IgG和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG建立免疫組織病理檢測技術。Yoshimizu,-M等(1988)[63]用免疫組織ABC法和間接熒光免疫法檢測了帶菌大麻哈魚的抗原。Ciuchini F等(1999)[64]等利用免疫組織化學技術對鰻弧菌感染后的小鼠和豬的各種組織進行了研究，取得了良好效果。

　　3.4.4 酶免疫法

　　酶免疫測定是指用酶標記抗原或抗體進行的抗原抗體反應，以底物被酶分解后的顯色深淺來反映待測樣品中的抗原或抗體含量。酶標法用普通顯微鏡即可觀察，對石蠟切片和新鮮組織均適用，并且細胞結構潔晰，組織定位準確，敏感性和特異性都優于免疫熒光法。

　　黃捷等[37]，于佳等[65](1995)制備WSSV單克隆抗體，并用該抗體進行了間接ELISA檢測，結果與對照組切片H—E染色結果較為一致，且能在發病前20—40d作出預報。

　　國外目前已經研究出了快速顯示技術，大部分是酶免疫鑒定法ELISA。Nadala Ec等以病毒多克隆血清作一抗，應用Western blot檢測對蝦血淋巴和鰓中的病毒，該方法適用于親蝦帶毒的檢測。Lewis(1986)則運用酶聯免疫法對對蝦病毒進行了檢測。Shankar,-K.M.等(1999)[66]用兔抗鯉科魚類抗體，用ELISA檢測了印度主要鯉科魚類的抗原。Dixon,-P.F.等(1996)[67]用免疫學方法檢測了彩虹鯛抗胰腺壞死病毒的抗體。

　　4 小結

　　近年來，在病理研究方面有了很大發展，已從顯微組織病理深人到亞顯微組織病理，組織化學、比較病理、以及肝腎等功能的病理生理研究等。截止1996年，已對40多種水產動物疾病的組織病理和10多種疾病的病理生理進行了研究[68]，查明了發病機理，從而為病理診斷和防治提供了理論依據。

　　綜合國內外水產動物病害研究的進展狀況，其總的趨勢為：研究種類、范圍越來越廣，包括各類水產動物、各類病因(病毒、細菌、寄生蟲、物理化學因素及營養性因素)；研究方法越來越先進、簡便和精確；研究深度也越來越深，從表面現象到DNA的解析。（杭州市水產技術推廣站，上海水產大學）
 
 


                                         編輯：鄧潔