高效魚類及貝類精子凍存項目這一高效凍存體系之所以能提高到工業化層面而不是機械地將數個小規模凍存進行疊加，歸功于三個特征：車間化和自動化、規范化質量控制以及過程模擬分析。
　　
　　文/ 圖 美國路易斯安那州州立大學農業中心水產研究站 胡軛
　　
　　精子凍存技術是一項在二十世紀中興起的冷凍保存技術。此技術首先在畜牧牛的育種中產生了革命性的影響，使歐洲和北美絕大多數養牛場得以依賴凍存精子進行配種。收集、保存和交易有價值的種牛的精子已經具有每年數億美元的全球化市場（圖1）。與此同時，其它畜牧業動物豬、馬、羊等，也在迅速發展和趕超這一技術。美國農業局下屬的國家農業種質項目不僅保存著近50萬凍存管的奶牛和肉牛精子，還有20萬份凍存的豬精子和6萬份山羊和綿羊的精子作為美國畜牧的基因資源備份。此外，關于馬和雞的精子凍存技術的研究和應用也是如火如荼。
　　
　　精子凍存技術給畜牧業尤其是優良品系的擁有者提供了一退一進兩手策略：退，能備份已有的遺傳性狀；進，能交易和運輸己有的遺傳物質而獲得其它感興趣的遺傳性狀。正是這一退一進的靈活性，促成了覆蓋全球的標準化凍存精子貿易網絡以及每年2300萬凍存管的巨大交易量。
　　
　　精子冷凍技術首次在魚類上的實踐是在二十世紀五十年代，和家畜的研究基本同時起步，但魚類和貝類精子的凍存始終沒有成為生產應用的主要技術之一。其主要原因在于水產養殖過去一直應用自然交配的育種方式。然而，出于對遺傳性狀的重視，科學家們想方設法去提高其保存效率。
　　
　　在過去的六十年內，對水產類生物精子的凍存研究以幾何倍數增長，各國也在凍存技術的支持下陸續開始建設種質庫保存和備份水生生物多樣性。聯合國糧農組織水產漁業部提出了重視水產遺傳物質的綱要，法國國家水生動物冷凍庫、墨西哥遺傳資源中心、以及中國水產科學研究院國家漁業種質平臺都是國家級資源庫的成功范例。另一方面，醫學和藥學的發展帶動下的模式生物魚的擴大養殖和原有的實驗室空間產生了沖突，歐洲和美國的很多模式魚類中心已經采用精子凍存技術來節省空間并通過郵寄凍存樣品來相互交流有研究價值的突變性狀。
　　
　　然而，針對多樣性保護的小規模凍存一方面不能實現規模化市場和生產的需求，一方面容易陷入對凍存步驟細節的過度考究而脫離了實際應用。而且，因為小規模的凍存成本高產量小，不能在實際生產中接受長時間的檢測，更無法在實踐中尋找自身的不足而進行進化升級。
　　
　　高效魚類及貝類精子凍存項目在過去的十年里曾數次列為美國農業局科研基金項目，其中路易斯安那州州立大學農業中心水產研究院水產種質實驗室是第一個實現魚類及貝類高效凍存的研究機構。該項目主體由我在2012年完成，將自動化設備和工業化設備與冷凍實驗技術結合，實現了質量穩定的大規模凍存，并在美國官方和私人養魚場進行了多次實踐，獲得了穩定的收益。這一高效凍存體系之所以能提高到工業化層面而不是機械地將數個小規模凍存進行疊加，歸功于三個特征：車間化和自動化、規范化質量控制、以及過程模擬分析。
　　
　　車間化和自動化是提高效率的第一步。這其中包括工作環境的選擇、設備和工具選擇、流水線設計。車間化保證了精子樣品在加工處理過程中移動的順暢，自動化降低了操作誤差。目前被采用的自動化分裝系統只有法國和德國有，但都使用0.5ml凍存管為基本容器。我們設計的高效凍存體系兼容了兩套系統（圖2），并采用美國需求量大的魚種——藍鯰魚作為示范魚種。整個系統已經實現了只用3個人工日產1000管的產量。這一產量已經和美國大規模雜交鮰魚（斑點叉尾鮰母魚和藍鯰魚公魚雜交）育苗場的精子日使用量相一致。為了進一步證明凍存精子在實際生產中的功效，我們連續3年和大規模育苗場合作，使用凍存精子替代育苗場所需新鮮采集的精子的一半，其它育苗程序都保持不變。最終，同樣體積的凍存精子和新鮮精子孵化出同等數目的苗。
　　
　　達到這個級別的孵化率也要歸功于高效凍存的規范化質量控制。整個凍存過程是精密的細胞生化反應，因此各個細節都可能帶入一定的影響因素，而因為細胞自我調節能力，累積的影響往往只在最后的產品中體現出來（較低的復蘇率）。因此每一個步驟都需要把帶入的影響減到最低。我們采用了工業工程的方法詳細地制定了每一個步驟的規程，同時也設定了數量化的質量標準。同時，這套凍存體系采用了數量化質量控制方法（三倍標準差原理），時時監控重要生產環節，最大程度的保證質量，在同行中處于領先地位。
　　
　　介于高效凍存系統的設置需要因地制宜、因物種而變化，已建立的高效凍存系統由于人員經費的關系只能在較小的范圍內進行調整。因此需要一種補充的分析手段來進行系統運行預測。我們借助ARENA（Rockwell Automation） 的可視化效果進行過程模擬（圖3），把整個高效凍存搬上電腦屏幕。這套虛擬化的高效凍存系統可以檢測人員增減、工時工量變化、生產線改良等各種假定，并給出時間、成本、產出等重要指標的統計分析。這些為進一步推廣和建設新的高效凍存提供了強大的信息資源以供參考。
　　
　　魚類的精子凍存已經在三文魚養殖中起到舉足輕重的作用。北歐的三文魚養殖已經完全采用了精子凍存進行魚卵孵化。優良的種魚的精子采集之后被凍存起來，并運送到需要的種苗場孵化魚卵。更進一步的是，由于三文魚的魚卵已經有了可靠的保存方法，三文魚跨國公司可以將魚卵和精子分別運送到加拿大和智利，并在當地進行孵化繁殖，減低了運輸成本，使場地更靠近消費群體。
　　
　　以三文魚為典范，目前，我們正在進一步推廣高效魚類及貝類精子凍存項目在水產尤其是育苗領域的應用（圖4）。精子冷凍項目所需的關鍵技術支持是人工授精。目前幾乎所有魚類和貝類都能進行人工授精。在人工授精的前提下，使用高效魚類及貝類精子凍存項目可以提供三個方面的優勢：保種苗、促育苗和強化特種品系控制。
　　
　　保種苗：優良的品種是水產的關鍵。一旦有了好的養殖品種，育種站將投入巨大的精力和資源保護和維護種魚。然而，維護活體的成本和風險都要遠遠超過維護凍存精子。有了凍存技術，帶有優良品質的精子將從種魚中收集并保存在液氮中。一旦出現極端情況種魚死亡，凍存的精子可以通過簡單直觀的三代回交，產生擁有被保存品種93%遺傳性狀的新魚（回交次數越多，新魚和被保存品種越接近）。而高效凍存的自動化系統精確標記了每一個凍存管，方便精確查找和定位已保存的樣品。
　　
　　促育苗：育種過程中因為選擇方向的多樣，往往會形成龐大的選擇矩陣。由于資源和時間的局限，在選育工程中的有價值的個體可能會因為和主要選擇方向不一致而被舍棄。同樣的情況也可能出現在已有品種不盡如人意，鑒于場地限制而被舍棄。一旦個體被銷毀，便沒有辦法再追溯和利用該品系的優良性狀。
　　
　　而采用凍存技術輔助育種可以實時“備份”各個中間品系，一旦需要調整選擇方向，可以方便地使用相應的凍存精子而不用從頭開始。并且，在育苗過程中使用盛有同一親本來源精子的凍存管可以方便地同時孵化數條母魚的魚卵，從而解決因選定的母魚不能同時產卵或不在同一個地域而無法活體育苗的問題。
　　
　　強化特種品系控制：特種品系指的是用來雜交的高價值種魚或是基因工程產生的“超級雄魚”（YY雄魚）或是用來產生三倍體后代的四倍體親本（如牡蠣）。這些品系有著極高的經濟價值，并常常牽涉到技術專利。因此，這些品系的活體都受到嚴格控制。使用凍存技術可以采集和保存精子，并將精子輸送到其他的育苗站進行育苗。這樣就避免活魚的流失，同時精子接受方即使有了精子，在沒有相應雌魚的基礎上，也不可能產生相應的特種品系。值得注意的是，品系的控制和轉移也可以應用到一般魚種上。尤其是當一個魚種站需要關閉或轉移時，及時凍存已有的種質資源可以方便轉移和其他魚種站的使用。
　　
　　高效魚類及貝類精子凍存項目將改變傳統觀念中只有活魚才能代表良種品系的思維，而建立品系和生殖細胞（精子）的直接聯系，從而實現更為靈活有效的轉移和管理。在互通有無的交易和交流中，使種苗場和農戶最大程度地受益于各種優良的遺傳性狀，整體提高中國水產的生產力和競爭力。
　　
　

　　圖3 虛擬藍鯰魚精子凍存過程在ARENA軟件上的可視化界面

　　
　　圖4 凍存精子輔助下的種魚種苗管理