牡蠣復雜完善的細胞內應激防御系統。圖片中的英文名詞為基因專用名稱。

 

 

9月19日，國際頂級學術刊物《自然》（Nature）雜志在線發表了基于多組學方法揭示的牡蠣對潮間帶逆境適應分子機制及貝殼形成復雜性的研究成果。這是我國水產養殖研究成果首次以長篇論文（article）形式登上該刊物。據統計，論文發表當日在線點擊和下載就達到了一萬多次。論文發表兩個月來，受到國內外的廣泛關注和好評。

 

“牡蠣基因組研究在面向國家重大戰略需求和重大科學前沿的結合上，做得非常好。研究成果的取得是一個很鼓舞人心的成績！”著名科學家、中國科學院院士朱作言毫不掩飾贊許與欣喜，對《中國科學報》記者坦言，“無論是國內還是國際，相關領域的研究基礎都非常薄弱，不像人類或者水稻基因組的研究那么多。項目面臨的挑戰是非常艱巨的，經過四年多的研究，能取得這樣高水平成果，是一件很不容易的事。”

 

繼水產養殖產業創造輝煌成就之后，中國在水產養殖基礎研究方面再一次為世界所矚目！

 

 

 

牡蠣是典型的海洋生物，也是潮間帶的優勢物種，對近海和海灣生態系統的穩定起到了重要調控作用。對海洋生物來說，潮間帶是一種極端環境。營固著生活的牡蠣對這種極端環境的高耐受性在海洋動物中極為罕見。

 

牡蠣在地球上的出現時間遠遠早于人類，化石證據表明，至少2億年來牡蠣外部形態沒有發生改變，它們年復一年，兢兢業業地把海洋里的二氧化碳轉變成碳酸鈣形式的貝殼。牡蠣是最早被人類利用的海洋生物之一，目前已成為世界上產量最大的海水養殖動物。

 

牡蠣還是文化內涵最為豐富的貝類，在人類文明史上留下了深深的烙印，莎士比亞的“The world is my oyster”是膾炙人口的諺語。

 

近些年來，基因組學發展迅速，影響越來越大，幾乎滲透生命科學的各個方面。中國科學院海洋研究所研究員張國范長期致力于海產動物遺傳與育種研究，特別關注在變化的海洋環境條件下，牡蠣等海洋貝類性狀的遺傳基礎和改良方法研究。他參加了由相建海研究員主持的中科院海洋功能基因組研究團隊，一直在思考并努力嘗試將基因組學應用于貝類遺傳改良研究。2008年4月，當中國工程院院士李寧在國家“863”計劃現代農業領域專家組會議上，提出“基因組育種是未來育種的主流發展方向”的觀點時，張國范進一步堅定了研究牡蠣基因組和開展基因組育種的信心和決心。

 

“我認為研究不具現實操作性。……研究基礎太薄弱。……需要投入的資金數目太大了，我們能做好嗎？……”當時，國內完成基因組測序的只有水稻、家蠶等少數物種，團隊成員出于對基因組研究領域的向往和陌生，表現出迎接挑戰的既興奮又忐忑的神情。然而，基于在貝類育種領域的多年實踐，對貝類生物學知識的深厚積累及對現代生物學前沿領域的深刻認識，張國范認準了這個有很大發展潛力的研究方向，對研究計劃相當堅定。

 

“最終會做好的！”他說，“只要努力做下去，必定能做出好成果來。”

 

隨后，張國范邀請長期從事牡蠣基因組研究的美國Rutgers大學教授郭希明加盟，兩人迅速對項目達成一致，確定了科學目標和整體研究思路。

 

2008年5月，張國范、郭希明聯合深圳華大基因研究院和國際同仁，正式發起了國際牡蠣基因組計劃（OGP）。項目得到了獐子島集團股份有限公司的大力支持。

 

就此，我國水產養殖動物首個基因組研究計劃開啟了序幕。

 

 

 

高多態性和高重復序列是牡蠣基因組的重要特點，也是國際上對這類生物基因組研究望而卻步的重要原因。作為非模式生物，它并沒有近緣物種基因組信息可供參考，項目的艱巨性不言而喻。尤其是項目采用相對經濟的第二代測序技術，盡管可獲得海量的數據，但測出的堿基序列卻都很短，這對后期的拼接組裝是個嚴峻的考驗。加之當時還沒有成功的案例，一些專家以不同形式對項目的技術可行性提出了質疑。而早在2005年，美國科學家就曾組織過牡蠣基因組研究計劃（OGC），但由于種種原因，計劃被擱置。中國科學家領銜的牡蠣基因組計劃能成功嗎？

 

此時，在牡蠣基因組計劃啟動前，另外一組美國科學家已開始對另一種海產貝類——帽貝進行了基因組測序。究竟第一個貝類基因組會由哪個團隊率先完成？

 

質疑沒有讓項目組失去信心，競爭無時無刻不激勵著項目組成員。負責基因組多態性研究的亓海剛回憶：“我們每天醒來的第一件事就是收發郵件，交流前一天的研究進展。通過網絡會議形式與國外專家開展學術溝通。大家幾乎把所有的時間都放在基因組數據解析上，能一起在實驗室附近餐館吃一頓飯就算是最好的休息。”

 

在會議室，記者看到，幾張簡單的木板床就在里屋。貝殼形成機制方向的負責人王曉通說：“經常在這里集中辦公，有時候工作到深夜，我們就睡在這里了。”

 

2010年7月31日，經過艱苦努力，項目組終于宣布繪制完成了世界上首張貝類全基因組序列精細圖譜。

 

“這是新的起點。基因組序列圖譜沒有最好，只有更好，后續需要改進的還有很多。”張國范平靜地說。

 

“2010年底，我們開始整理手頭的研究數據，感覺研究成果足以整理兩篇重量級論文，同時投到《自然》，但由于時間緊迫以及團隊成員有限，我們最終采取了集中精力整理一篇頂級論文的策略。”李莉，這位年輕美麗且韌勁十足的女科學家自豪而又有些惋惜地說。

 

2010年底到2011年10月，課題組十余人進駐深圳華大基因研究院，進入了全面封閉的研究狀態，無節假日休息，埋頭整理實驗數據和論文。以研究生身份作為主力隊員“打滿全場”的張琳琳仍然記得，十一長假，在炎熱的深圳，空蕩蕩的辦公樓里只有項目組成員在埋頭苦干。張琳琳在牡蠣基因組研究中的孜孜以求也成就了她的一篇優秀博士學位論文。

 

終于，不負眾望，經過4年多的辛勤努力，項目組最終完成了備受矚目的研究成果。2012年9月19日《自然》雜志以長篇論文形式在線發表，10月4日紙質版刊印出版。

 

我國著名貝類學家、中國工程院院士張福綏指出：“這是國際貝類學研究的重大成果，提升了我國貝類及海洋和水產研究的學術水平，為貝類及其他水產動物的遺傳改良奠定了重要的遺傳學基礎。”

 

 

經過兩年多的努力，項目組于2010年下半年成功完成基因組精細圖譜的拼接組裝。

 

牡蠣基因組的高雜合性和高重復序列對拼接來說具有很大的挑戰性。如果采用大熊貓等的全基因組鳥槍法策略，根本無法完成如此復雜的基因組項目。因為采用這樣的方法，就會把高度雜合區域的同源序列當做基因組不同的位置都組裝出來，而很多不同位置的高度相似的重復序列被誤認為來自同一個位點。為此，項目組開發了基于fosmid pooling的多層次分級組裝方法，很好地解決了這個問題。

 

牡蠣基因組測序使用的是一只在美國經過4代近交的被昵稱為“丹尼斯”（Dennis）的牡蠣。首先，項目組把牡蠣基因組DNA打斷成40 Kbp（千堿基對）左右的片段，每個片段插入一個fosmid載體并轉染進細菌，這樣每個菌群就攜帶牡蠣基因組的40 Kbp左右的一段DNA序列。一共構建了大約15萬個這樣的菌群，整個文庫攜帶了大約5.8 Gbp（十億堿基對）的DNA片段，相當于牡蠣基因組大小的十倍左右。如果在整個文庫中隨機挑選90個菌群，其攜帶的90個片段來自基因組同一個位點或者彼此是重復序列的幾率會非常低，這樣就可以解決高雜合和高重復序列對拼接造成的困難。把它們混合在一起測序并通過第一級組裝獲得DNA拼接序列，這樣既降低測序成本，又能保證這90個片段的順利拼接。隨后，項目組一共測序并拼接了1600多個混池，獲得了更多的拼接序列。將這些序列再進行第二級組裝，獲得超級重疊序列群。最后，利用大片段測序文庫的信息，對這些組裝序列進行定位和排序，最終獲得了牡蠣基因組組裝序列。有了這個良好的序列組裝基礎，就可以進一步深入了解牡蠣基因組結構特征，發現平均每43 bp的序列中就存在一個由SNP（單核苷酸多態性）或者InDel（插入—缺失）導致的變異，比大多數已有報道的物種都要高，其變異頻率是人類等哺乳動物的10倍以上。此外，牡蠣基因組的重復序列含量也非常高，占到了基因組的36%，一些轉座子仍然十分活躍。在此基礎上，借助轉錄組、表達譜以及蛋白組等多組學技術，就可從多層次多視角對牡蠣各種生命活動，包括對逆境適應的分子機制進行精細解讀。

 

 

項目組利用各分類階元代表性物種共有的單拷貝基因，建立了分子進化樹并估算各個分支之間的分化距離。研究發現兩側對稱動物與輻射對稱動物大約在6.9億年前發生分化，而牡蠣與人的共同祖先大約在6.2億年前開始分化。分化年代的估算結果支持生物物種大爆發是發生在早寒武紀之后一段時間的學術觀點。

 

項目組對牡蠣不同發育時期、不同器官的樣品進行了全基因組表達研究。從受精開始，每隔1個小時取樣一次，對前24個小時的發育進行高密度發育譜分析。此后，每天取樣一次，直到附著變態形成稚貝。一共獲得了38個發育時期的基因表達信息。這些數據對解讀不同基因的功能及其調控機制提供了重要參考以及龐大的數據基礎。

 

項目組以進化發育生物學中受到廣泛關注的HOX基因簇為例，對牡蠣的發育相關基因特點進行了分析。HOX基因是重要的發育基因，生物體的頭尾、左右等體制形成主要由這一類基因決定，如果這類基因在人類中變異，會造成多指癥等多種疾病。HOX基因簇包含大約10～15個成員，它們在染色體上的物理位置是依次排列的，在人類中以HOX1～HOX13命名其13個基因。由于脊椎動物經歷了兩次基因組復制，因此在人類中可以找到4條HOX基因簇。而牡蠣和其他無脊椎動物一樣，只有一條HOX基因簇。且牡蠣HOX基因的排列順序被其他基因插入而打斷，造成這些HOX基因在發育過程中的表達時序也被打亂。而且牡蠣還缺失HOX基因簇中的Antp基因。這些變化造成了牡蠣什么樣的生物學改變, 它的功能又是由哪些基因來補償？一系列科學問題尚待進一步研究。

 

 

項目組把牡蠣基因組和人、海膽等7個物種的基因組進行比較，發現了8654個牡蠣特異的基因，這些基因可能在牡蠣或者貝類的進化中起到重要作用。有趣的是，通過功能注釋發現這些基因的功能多與抗性防御相關。而通過人工檢驗，進一步對抗性相關基因進行細致研究，發現一些基因家族在牡蠣中的成員數量遠遠超過其他物種，這些基因的功能涉及到蛋白折疊，氧化和抗氧化，凋亡和免疫反應等。這些功能都是牡蠣抵抗逆境不可或缺的。比如熱激蛋白70（HSP70）在生物抵抗高溫等各種逆境中發揮著重要作用，研究人員在牡蠣基因組中鑒定出88個HSP 70基因，數量遠遠高于人類中的17個和海膽中的39個。

 

為了進一步調查這些幫助牡蠣抵抗嚴酷環境的基因是如何工作的，他們進一步設計實驗，檢測牡蠣對逆境脅迫的反應。通過檢測牡蠣在不同溫度、鹽度、露空和重金屬等60多個逆境條件下的基因表達情況，發現5800多個基因在至少一種應激下發生明顯的表達變化，很多調控基因會在不同的逆境條件下被“征用”。同時還發現逆境條件下起作用的基因往往傾向于在基因組中存在其他拷貝，這意味著防御相關基因會復制自己從而隨著進化不斷增多，這可能對牡蠣適應復雜多變的潮間帶生活意義重大。

 

牡蠣在潮間帶生活，每天都要經歷兩次潮漲潮落，規律性地處在露空環境下。研究發現，牡蠣的凋亡抑制蛋白（IAP）基因數目不僅高度擴張，而且在長時間的露空后， 5個凋亡抑制蛋白的表達量上調了67倍，其他凋亡抑制因子也有相應的上調。除露空之外，這些凋亡抑制因子在高溫和低鹽條件下也有上調。這些現象充分表明牡蠣中存在著一個強有力的凋亡抑制基因網絡，讓牡蠣能夠耐受露空等逆境脅迫。在露空條件下，牡蠣還會同時受到夏季高溫或冬季冰凍帶來的溫度脅迫，項目組發現，牡蠣也進化出了精密的調控系統來應對這些挑戰。牡蠣在受熱刺激后，有5個HSP70家族的基因表達量上調了2000倍，約為該樣本所有轉錄本數量總和的4.2%。這些基因和凋亡抑制因子一樣，在牡蠣中既存在復制擴張又能夠在受到溫度刺激后大量上調，從而使其能夠生活在溫度可以高達近50℃、低溫逾-20℃的潮間帶環境。

 

 

牡蠣通過進化出復雜的基因調控系統來應對逆境的本領著實讓人驚訝。其實，牡蠣第一個讓人想到的防御措施并不是這些基因，而是那些質地堅硬、奇形怪狀的貝殼。早在5億多年前，貝殼便出現在遠古地球生物中，那時背負著厚重的貝殼或許是生物界的“時尚寵兒”，當然貝殼也很實用，是一種很強大的防御裝備。鈣化的貝殼為貝類提供了很好的抵御捕食、干燥、雨淋等環境變化的物理屏障。而近些年愈來愈嚴重的海洋酸化將會干擾和破壞這道屏障的功能，影響貝類的生存，進而影響近海生態系統的穩定。貝類的貝殼主要由精巧的有機框架和無機成分構成，無機成分主要是文石和方解石，它們都是碳酸鈣結晶。一般認為貝殼的有機框架由外套膜分泌的幾丁質、絲蛋白和酸性蛋白構成，其中酸性蛋白控制碳酸鈣晶體的結晶和生長。

 

項目組提取了牡蠣貝殼中總蛋白，測定了牡蠣貝殼蛋白譜，發現了至少259種蛋白存在于牡蠣貝殼中。令人驚奇的是，貝殼中發現了很多意想不到的蛋白，它們可能參與了貝殼基質框架的構建和修飾。重要的是，大部分貝殼蛋白是非分泌性蛋白，這與目前流行的貝殼是外套膜分泌形成的觀點明顯相悖，表明貝殼的生物礦化機制遠比目前人們的認識要復雜得多。經過分析認為，貝殼基質和細胞外基質可能存在一定的相似性，一些在細胞外基質中存在的特征蛋白在外套膜中高度表達，并在貝殼中出現。與在細胞外基質中一樣，血細胞可能也在貝殼基質中參與了纖連蛋白樣纖維的組裝。

 

項目組還在外殼蛋白中發現眾多具有細胞基本代謝功能的蛋白質，其中包含不少外來體蛋白，這從分子層面表明，細胞和外來體可能參與了外殼的形成。著名的酪氨酸酶竟然也在貝殼中被發現了，一般來講，酪氨酸酶與黑色素的形成有關，但研究中發現大多數的酪氨酸酶基因在不生成黑色素的外套膜內側表達量更高，說明貝殼中的酪氨酸酶還有其他功能，也許酪氨酸的氧化與交聯對于貝殼基質框架的形成具有重要意義。

 

總之，不但外套膜分泌的絲蛋白和多種其他蛋白參與了牡蠣貝殼有機框架的形成，而且很可能還有血淋巴細胞和外來體蛋白也參與了該框架的構建。研究表明，貝殼中存在大量的生命活動，其復雜性遠遠超過人們的既往認識。

 

 

一個研究成果的誕生離不開團隊，更離不開團隊身后的各種有力支持。

 

牡蠣基因組項目瞄準海洋和水產領域的關鍵科學和技術問題，具有前瞻性、創新性和重要的現實意義，是一個系統的科學工程，任務重、困難多、投入大。研究過程中，項目組得到了中國科學院、科技部、國家自然科學基金委、農業部、山東省和獐子島集團的大力支持，是政企研合作的又一杰作。

 

研究之初，項目組面臨諸多問題，首要就是經費。當時，水產領域基因組研究計劃尚未啟動，在極需經費支撐的時候，獐子島集團董事長吳厚剛的一句話令張國范懸著的心放了下來，“你就干吧，費用由獐子島負責”。正是這筆一周內就撥付到位的巨額經費，保證了項目順利、及時啟動和實施。

 

吳厚剛對記者表示，集團深刻認識到科技對產業發展的巨大推動作用和基因資源對產業可持續發展的重要性。重資支持牡蠣基因組的研究，是從國家需求、產業發展的高度，從自身戰略發展的角度作出的重要決定。集團對牡蠣基因組計劃的后續研究與未來的產品研發充滿了信心。

 

2009年下半年，國家“863”計劃開始支持包括水產養殖在內的農業基因組研究，后又啟動了國家貝類“973”計劃項目。國家經費的及時到位進一步保障了項目研究深度和廣度的拓展。

 

項目首席科學家張國范表示，牡蠣基因組研究成果能在國際頂級學術刊物上發表，是團隊成員共同努力和各方面支持的結果。得益于建立了一支集國內外優勢力量的研究團隊，得益于有國家龍頭企業和國家科技部門的有力支撐，得益于有諸多同行專家學者的鼎力支持，得益于有中國科學院良好的科研環境，更得益于中國改革開放30多年經濟社會的快速發展。當然，也得益于他們選擇了一個為學界矚目的科學問題，而研究的對象既具典型性，又是國際面孔。

 

在取得該項為國際矚目的重要成果的同時，更重要的是還涌現出一批積極進取、能攻堅克難的學界青年翹楚。正是由于有這樣一批青年科學家的勤奮與智慧，才使牡蠣基因組項目的成果異彩紛呈，耀眼奪目。

 

項目的另一位首席科學家郭希明是美國Rutgers大學教授，曾入選中科院“百人計劃”，獲“國家杰出青年基金”支持，是中科院海洋功能基因組海外團隊成員，為該成果的取得作出重要貢獻。郭希明說：“項目組建立的牡蠣基因組數據庫，包含了大量的基因組和轉錄組信息，為國際海洋生物學、比較基因組學和貝類水產基因組育種研究提供了堅實的基礎。”

 

華大基因的青年科學家方曉東、羅瑞邦等人總能在出現技術瓶頸的時候提出有創新性的解決方案，而“大總管”王俊更是把牡蠣項目列為最高優先級進行重點關注，并在具體工作中給予諸多中肯指導。

 

項目得到美國、英國、克羅地亞和德國眾多科學家的合作支持，他們以各自領域的專業知識，為基因組數據的分析和解析作出了重要貢獻；同時，也得到國內眾多科學家的關心和幫助，充分體現了中國科技界的齊心協作精神。

 

正是聚集了這些支持與幫助，匯八方之力，協同創新，牡蠣基因組項目進展快速。

 

 

 

2011年11月，《自然》雜志資深編輯M. Skipper博士來訪中國，第一時間關注到牡蠣基因組成果。2011年12月，項目組以預投稿的形式將論文提交給編輯部，并于2012年1月30日正式投稿。

 

據介紹，《自然》每周能收到200余篇投稿，其中四分之三以上都被直接婉拒，只有8%的論文最終能發表，其中以長文形式發表的僅有3～5篇。

 

就在審稿過程中，2012年2月，日本學者關于珍珠貝基因組測序的一篇論文公開發表，成為世界上第一個關于貝類基因組的報道，使得項目組措手不及。然而，該基因組拼接效果較差，且缺少有意義的生物學解析，未引起《自然》等刊物關注。

 

牡蠣基因組論文的審稿過程可謂漫長而艱難。作為共同第一作者的許飛還記得這長達幾個月的過程，三位審稿人一致認可論文的重要性和研究高度，但在第一輪就提出近60個問題。每次應對評審意見，對項目組成員都是一場新的戰斗，而大家總是戰斗到截止時間的最后一刻。事實上，這種修改也使論文有了新的提高。實驗室的門衛依稀記得在凌晨六點論文修改稿提交之后大家興奮而疲勞的神情。在合作者們的共同努力下，經過三輪修改，稿件最終說服了三位審稿人。

 

郵件中，審稿專家寫道：“這是一項大工程，工作的完整性令人難以置信，將會成為基因組研究的標桿。祝賀這個團隊！趕快發表，不要再拖了。”

 

牡蠣基因組的高質量拼接效果及其對科學問題的深刻闡述，最終得到這個國際頂級學術刊物的青睞！

 

成果發表后，得到了世界上相關領域科學家的高度關注。相關媒體如英國BBC news，美國《華盛頓郵報》、《科學美國人》、《科學日報》，“美國國家廣播電臺”等在第一時間進行了報道。來自英國、美國、巴西、西班牙等國家的媒體記者紛紛給項目組首席科學家發來采訪要求。《華盛頓郵報》說這是“第一個被充分測序的貝類基因組”。 一時間，貝類、牡蠣、基因組等關鍵詞成為科技新聞媒體的熱點。美國的一個貝類學實驗室第一時間在其網站主頁上添加了牡蠣基因組數據的鏈接地址，并且感慨“終于成為現實！”

 

據記者了解，牡蠣基因組計劃發布的數據量之大，涉及面之廣，是除了線蟲、果蠅、斑馬魚、小鼠等少數幾個模式物種之外少見的，為研究和利用海洋生物基因資源提供了重要基礎。首先是促進牡蠣或貝類的分子育種進入基因組育種時代。科學家通過研究大量的生長發育、生殖性控和抗逆抗病等重要性狀的相關基因功能，對其遺傳改良奠定基礎。其次是促進海洋生物抗性免疫生物學研究的發展，對重要病原與宿主的相互關系研究，將進一步揭示病毒的感染、復制、調控機理、阻斷病毒感染和設計抗病藥物等，為研制疫苗、抗體和新型藥物提供技術平臺。第三，通過大量的基因數據可以篩選和發現海洋生物特有活性物質，開發具有自主知識產權的海洋藥物、功能基因產品、新材料等。如牡蠣固著相關的物質在牙科、仿生制造等行業都具有很好的應用前景。第四，一些基因產物可以開發為環境監測產品，用于生態監測、生態修復等。

 

“牡蠣基因組序列精細圖譜的繪制完成僅僅是個開始，在探索海洋生物對逆境適應進化機制和發掘海洋基因資源的萬里長征中，我們只是邁出了比較堅實的一小步。”張國范表示，下一步將抓緊對功能基因進行深度驗證，全面解析牡蠣典型性狀，開展基因組育種、基因產品開發和生物新材料等應用研究，提升我國海洋和水產生物基因資源研發水平，促進海洋和水產養殖產業健康和可持續發展。

 

朱作言強調：“牡蠣基因組作為中國水產養殖成果的代表，搭建了高水平的研究平臺，是很鼓舞人心的，但不能僅停留于此并津津樂道，而是要繼續往前走。只要堅持下去，水產科學基礎研究一定能做得更好。”