海南大學(xué)，海南  �？�，570228
 
　　自2009年以來，南美白對蝦“早期死亡綜合癥”（Early Mortality Syndrome）在亞洲地區(qū)爆發(fā)并蔓延，給亞洲各國的對蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。最近也有學(xué)者將該病稱為“急性肝胰臟壞死綜合癥”（Acute Hepatopancreas Necrosis Syndrome）。有關(guān)南美白對蝦“早期死亡綜合癥”的研究已有報(bào)道，如Flegel T.W. 、Lightner D.、Eduardo M. Leano等曾報(bào)道南美白對蝦“早期死亡綜合癥”的主要發(fā)病癥狀和致病的可能性因素，但對于該病的原發(fā)性病原和病因至今尚未有確切的定論。

　　1 南美白對蝦“早期死亡綜合癥”的發(fā)病特點(diǎn)
 
 
2010～2012年期間，筆者在海南調(diào)研了大量發(fā)生“早期死亡綜合癥”的蝦塘并走訪了眾多的養(yǎng)殖戶，通過現(xiàn)場的觀察、采樣檢測及與養(yǎng)殖技術(shù)人員的交流，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)和不同季節(jié)發(fā)生的“早期死亡綜合癥”都有許多相同的發(fā)病特點(diǎn)。并采集了放養(yǎng)30天左右攝食生長正常的和患“早期死亡綜合癥”的南美白對蝦活體樣品。正常組對蝦采自海南省文昌市林梧養(yǎng)殖場的6口池塘，患病組對蝦采自海南省澄邁縣的馬村養(yǎng)殖場和南港養(yǎng)殖場的6口池塘。對蝦樣品通過無菌操作和低溫保存，帶回實(shí)驗(yàn)室分別進(jìn)行肝胰臟和中腸組織切片、肝胰臟的弧菌和可培養(yǎng)細(xì)菌的檢測，并采用PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）方法檢測白斑綜合癥病毒（WSSV）、桃拉綜合癥病毒（TSV）和皮下及造血器官壞死病毒（IHHNV）三種特定病毒。現(xiàn)將“早期死亡綜合癥”的發(fā)病特點(diǎn)和相關(guān)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果歸納整理如下，旨在為南美白對蝦“早期死亡綜合癥”的防治及流行病學(xué)的研究提供參考。
 
 
　　1.1  對蝦“早期死亡綜合癥”的主要外觀癥狀
 
蝦苗放養(yǎng)10-30天為該病的高發(fā)期，患病對蝦體色呈白濁并微紅，多數(shù)情況下肝胰臟異常腫大，質(zhì)地松軟，顏色呈淡白或淡黃色；部分患病對蝦的肝胰臟明顯萎縮，質(zhì)地變硬（圖1）。發(fā)病期間，患病對蝦通常在池塘水面緩慢游動或趴伏于池塘邊坡上，失去食欲，胃、腸充塞度極差，嚴(yán)重者胃腸呈紅色。該病病情發(fā)展十分迅速，死亡率和排塘率極高，從發(fā)現(xiàn)少量病蝦到排塘，時(shí)間最短的僅2-3天。患病對蝦樣品經(jīng)PCR方法檢測，通常未被檢出攜帶WSSV、TSV、IHHNV等特定病毒，但肝胰臟和腸組織勻漿經(jīng)TCBS培養(yǎng)基的培養(yǎng)，均被檢測出有大量的弧菌。對蝦的發(fā)病通常與蝦池藻類的老化死亡有密切關(guān)系，檢測池水的弧菌數(shù)量較大，且往往是綠色弧菌占絕對優(yōu)勢。美國亞歷桑那大學(xué)的Lightner教授在2012年8月的曼谷研討會上指出，到目前為止，從越南和中國采集的患病對蝦樣本的組織濾液在人工感染試驗(yàn)中無法證實(shí)該病是由病毒引起的，病蝦樣品的PCR測試結(jié)果顯示，“早期死亡綜合癥”與白斑綜合癥病毒、黃頭病毒、傳染性肌肉壞死病毒和桃拉綜合癥病毒沒有直接的關(guān)系。2013年3月，拜耳（四川）動物保健有限公司的劉濤博士應(yīng)Chalor教授的邀請前往泰國農(nóng)業(yè)大學(xué)參觀訪問，據(jù)Chalor教授介紹，他們的實(shí)驗(yàn)中心在一年多前就嘗試用病蝦作為實(shí)驗(yàn)材料開展人工感染試驗(yàn)，甚至用病蝦的肝胰臟勻漿濾液注射到健康的對蝦，其結(jié)果也不能導(dǎo)致健康對蝦的發(fā)病，認(rèn)同“早期死亡綜合癥”不是由病毒引起的觀點(diǎn)。

 
圖1  示患病對蝦肝胰臟的腫大和萎縮
 

　　1.2  對蝦肝胰臟和中腸的組織學(xué)觀察
 
 
 
　　通過顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)正常對蝦和患病對蝦肝胰臟和中腸的組織形態(tài)有很大的差異。正常對蝦的肝胰臟為復(fù)管狀腺，由多級分支的肝小管組成，肝小管管壁由單層細(xì)胞構(gòu)成，管腔呈五角或四角星形，腺細(xì)胞正常（圖2）；中腸管壁組織厚度均勻、致密，腸腔中充滿內(nèi)含物（圖4）�；疾�對蝦肝胰臟的腺細(xì)胞間隙變大，腺細(xì)胞核變小，腺細(xì)胞有不同程度的自溶現(xiàn)象，肝小管變形（圖3）；中腸腸壁變薄，腸粘膜脫落并散落于腸腔內(nèi)，腸腔中沒有內(nèi)含物（圖5）。
圖2 正常南美白對蝦的肝小管橫切面  


　圖3 患病南美白對蝦的肝小管橫切面


圖4正常南美白對蝦的中腸橫切面



　 圖5患病南美白對蝦的中腸橫切面  

　　1.3  對蝦肝胰臟弧菌和可培養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)量
 
 
 
　　通過對生長正常和患病對蝦的活體樣品體內(nèi)細(xì)菌的檢測，發(fā)現(xiàn)兩者的肝胰臟和腸道均有大量的細(xì)菌，但兩者細(xì)菌的數(shù)量和種類有顯著的差異。正常組對蝦肝胰臟的可培養(yǎng)細(xì)菌密度范圍為1.59×106～5.83×106cfu·g-1，平均3.18×106cfu·g-1；弧菌密度為1.46×105～2.99×105cfu·g-1，平均1.97×105cfu·g-1，占可培養(yǎng)細(xì)菌的7.64%；在TCBS培養(yǎng)平板上觀察，黃色弧菌占絕對優(yōu)勢，密度范圍為1.20×105～2.86×105cfu·g-1；綠色弧菌的密度范圍為0.6×104～3.9×104cfu·g-1，黃色弧菌的密度是綠色弧菌密度的10.25倍，其中的一株黃色弧菌為絕對優(yōu)勢菌株。
 
　　患病對蝦肝胰臟的可培養(yǎng)細(xì)菌密度為2.87×106～8.24×107cfu·g-1，平均2.71×107 cfu·g-1；弧菌密度為1.28×106～3.59×106cfu·g-1，平均1.87×106cfu·g-1，是正常對蝦組的9.5倍，弧菌占可培養(yǎng)細(xì)菌的15.89%；在TCBS培養(yǎng)平板上觀察，綠色弧菌占絕對優(yōu)勢，密度范圍為1.02×106～2.97×106cfu·g-1，平均1.42×106cfu·g-1，黃色弧菌的密度為0.2×106～0.63×106cfu·g-1，綠色弧菌密度是黃色弧菌密度的3.16倍，其中的一株綠色弧菌為絕對優(yōu)勢菌株。
 
　　兩株優(yōu)勢菌株均為革蘭氏陰性菌，菌體為彎桿狀，無芽孢，對弧菌抑制劑O/129均敏感，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，生長需NaCl，可利用D-甘露醇，在TCBS平板上分別形成黃色和綠色的圓形菌落，具有弧菌屬的典型特征。
 
　　今年3月，Chalor教授向拜耳（四川）動物保健有限公司的劉濤博士介紹，他們在泰國和其它地區(qū)也發(fā)現(xiàn)病蝦的肝胰臟內(nèi)有大量的細(xì)菌存在。他還向記者透露，Lightner教授最近發(fā)現(xiàn)了一些有趣的現(xiàn)象，在越南的一些區(qū)域，他們在“早期死亡綜合癥”病蝦體內(nèi)分離出一些細(xì)菌，目前還在研究試驗(yàn)當(dāng)中，看是否就是這些細(xì)菌導(dǎo)致對蝦的“早期死亡綜合癥”。
 
　　1.4  兩株弧菌優(yōu)勢菌株對南美白對蝦的人工感染
 
我們從患病對蝦的肝胰臟分離出一株弧菌優(yōu)勢菌株，在TCBS培養(yǎng)基上其菌斑的顏色呈綠色；正常對蝦的弧菌優(yōu)勢菌株則是一株黃色弧菌，在TCBS培養(yǎng)基上其菌斑的顏色呈黃色。在實(shí)驗(yàn)室條件下，分別用兩株弧菌優(yōu)勢菌株以不同的密度梯度接種到水族箱對健康的南美白對蝦幼蝦進(jìn)行人工感染試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：沒有接種任何菌株的對照組的對蝦攝食生長正常，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，水體和對蝦肝胰臟內(nèi)均檢出少量的黃色弧菌，但未檢出綠色弧菌；在接種綠色弧菌的試驗(yàn)組中，只要水中綠色弧菌的接種密度達(dá)到0.5×104cfu·mL-1時(shí)，水族箱的對蝦從接種的第3天開始出現(xiàn)死亡，10天內(nèi)的累計(jì)死亡率達(dá)到72%；當(dāng)接種密度為2.5×104cfu·mL-1時(shí)，10天內(nèi)的累計(jì)死亡率達(dá)到98%。死亡對蝦的外表癥狀與“早期死亡綜合癥”基本一致，出現(xiàn)肝胰臟腫大、顏色淡黃、失去食欲、空腸空胃等典型癥狀，并從死亡幼蝦的肝胰臟檢測到大量的綠色弧菌和少量的黃色弧菌；在接種黃色弧菌的試驗(yàn)組中，試驗(yàn)期間幼蝦攝食生長基本正常，僅有少量幼蝦死亡，10天內(nèi)的累計(jì)死亡率為15.5%～22%，死亡幼蝦沒有“早期死亡綜合癥”的典型癥狀，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，在養(yǎng)殖水體和幼蝦的肝胰臟中均檢出大量的黃色弧菌，但未檢出綠色弧菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩株弧菌優(yōu)勢菌株在養(yǎng)殖水體中均可經(jīng)口感染對蝦的消化器官，有很強(qiáng)的感染能力，并可在對蝦的消化器官中定植并生長繁殖。通過比較兩組對蝦的累計(jì)死亡率，筆者認(rèn)為綠色弧菌比黃色弧菌具有更強(qiáng)的毒力。本次人工感染試驗(yàn)是在實(shí)驗(yàn)室的條件下進(jìn)行，由于受光照的限制，養(yǎng)殖水體中沒有藻類，說明在沒有藻類存在情況下，對蝦同樣會出現(xiàn)“早期死亡綜合癥”的癥狀；本次實(shí)驗(yàn)設(shè)置的綠色弧菌最小接種密度為5.0×103cfu·mL-1，10天內(nèi)幼蝦的累計(jì)死亡率達(dá)到72%，綠色弧菌在南美白對蝦養(yǎng)殖水體中的安全密度應(yīng)少于5.0×103cfu·mL-1。
  
2“早期死亡綜合癥”的防控措施
　　
　　南美白對蝦“早期死亡綜合癥”的發(fā)生除了與大量的弧菌感染有密切關(guān)系之外，也和養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境差、藻毒素的影響以及對蝦自身體質(zhì)虛弱等諸多因素有關(guān)。