中國水產門戶網報道    摘 要:本文介紹了固定化微生物技術的發展史和吸附法 (載體結合法)、包埋法、共價法、交聯法等6種固定化微生物的制備方法以及固定化微生物技術在水產養殖中的應用。
    關鍵字：固定化；微生物；水產養殖；制備
 
    隨著水產養殖業的發展，養殖對象、規模日益擴大，細菌性、病毒性等病害的感染機率也隨之增大。而抗生素的大量使用，不僅使一些致病菌產生較強的抗性，同時也導致了魚腸道內的有益菌群生態失調，從而影響魚類的抗病能力。要減少抗生素使用，保護生態環境，應另辟蹊徑。微生態制劑則可相對有效地解決這一問題。所謂微生態制劑，是利用對魚蝦等動物有益的微生物或促進物質經特殊加工工藝制成的活菌制劑。它可用于水中微生態調控、凈化水質，能產生一定的生物效應或生態效應；也可用于調整或維持動物腸道內微生態平衡，達到防治疾病、提高健康水平和促進生長的目的。目前微生態制劑被廣泛應用在水產養殖業上，但在應用中發現：由于微生物受外界環境影響較大,抗不良環境沖擊能力差,一旦系統受損難以恢復，因此處理效果不穩定。為了解決這個問題，人們將目光投向了固定化微生物技術。固定化微生物技術不僅有利于優勢菌種的固定，提高難降解有機物的降解效率；還能在生物裝置內維持高濃度的生物量，在無細胞沖出的前提下，液流量大，提高了處理負荷，減少了處理裝置的容積；并且易于固液分離；同時微生物被高分子材料包埋后抗毒性能和耐受力明顯增加。
 
    1固定化微生物技術
    固定化生物技術起始于1959年,由Hattori等人首次實現了大腸桿菌的固定化,此后發展迅速。它包括固定化酶和固定化細胞技術。所謂固定化是指利用物理或化學手段將游離的細胞或酶與固態的不溶性載體相結合，使其保持活性并可反復使用的一種技術。由于固定化在實際生產中可使生產工藝自動化、連續化，提高酶和細胞的穩定性和反應效率，降低成本，因而迅速成為生物工程學中的一個研究熱點。顧名思義，固定化微生物技術是指利用化學的或物理的手段將游離的微生物定位于限定的空間區域，并使之成為不懸浮于水仍保持生物活性，可反復利用的方法。20世紀70年代以后，由于水污染嚴重，迫切需要一種高效、快速且能連續處理的廢水處理技術，微生物固定化技術從而在污水處理中得到廣泛應用，效果較好，至今已經形成了較為完備的理論和方法。
 
    2固定化微生物的制備方法
    從固定化的定義就可以看出，要實現微生物固定化就要求有固態的不溶性載體。目前常用的載體可分為無機載體、有機高分子載體和復合載體三大類型。常見無機載體有硅藻土、多孔玻璃、石英砂、活性炭等；有機載體有瓊脂、角叉萊膠、海藻酸鈣和一些有機合成高分子凝膠（如聚乙烯醇凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、光硬化樹脂）等；復合載體是由無機載體和有機載體材料結合而成，使兩類材料的性能互補。
    固定化微生物的制備方法主要有吸附法 (載體結合法)、包埋法、包絡法、共價法和交聯法(架橋法)和無載體固定法6種。
    2.1吸附法
    所謂吸附法就是依據帶電荷的細胞和載體之間的靜電、表面張力和粘附力的作用，使細胞固定在載體表面和內部形成生物膜。這是一種廉價有效和比較常用的方法，其可分為物理吸附法和離子吸附法兩種。物理吸附法是使用具有高吸附能力的物質,如硅膠、活性炭、多孔玻璃、碎石、硅藻土、多孔磚、陶瓷片、木屑等吸附劑，將微生物吸附在表面使其固定化；離子吸附法是利用微生物在解離狀態下離子鍵合作用而固定于帶有相反電荷的離子交換劑上，常見的離子交換劑有DEAE-纖維素、CM-纖維素等。
    2.2包埋法
    包埋法是將微生物包裹于凝膠格子或聚合物半透膜微膠囊中的方法。包埋材料通常采用聚乙烯醇(PVA)、丙烯酞胺(ACAM)、聚乙烯乙二醇（PEG）、瓊脂、海藻酸鈣、卡拉膠等，其中天然高分子凝膠對微生物細胞無毒，傳質阻力小，但結合強度小；有機合成高分子凝膠強度高，影響微生物生物活性，同時傳質阻力大。由于包埋法所需條件溫和、回收率較高，具有一定的普適性，選擇適當的包埋材料使其不會破壞微生物的活性是這項技術的關鍵，但該方法空間位阻大，故不適于固定對大分子有機物作用的微生物。共固定化技術是在混合發酵技術和固定化技術基礎上發展起來的一門新技術，就是將幾種細胞同時包埋于同一載體中形成共固定化細胞系統。這種系統穩定，可將不同的幾種微生物協同作用。混合細胞的固定化技術綜合了混合發酵和固定化技術的優點，與遺傳工程構建的細胞相比更有希望在短時間內應用于生產。
    2.3包絡法
    20世紀90年代初期，為克服吸附法和包埋法固定微生物的缺點，又提出用包絡法固定微生物的新技術。包絡法以人工合成生物相容性好的聚丙烯酸酯共聚物基體型多孔顆粒為載體。鄭邦乾等研究表明，微生物既可在該多孔載體外表面生成機械強度高的生物膜,又可在載體內孔中聚集大量的微生物，增大了微生物的聚集密度，而且提高了生物粒子承受水力負荷的能力。
    2.4共價法
    共價結合法是細胞表面上官能團和固相支持物表面的反應基團形成化學共價鍵連接,從而固定微生物。該方法固定化微生物穩定性好，不易脫落，但限制了其活性，同時反應激烈,操作與控制復雜苛刻。常用于共價法的功能基團有氨基、羚基、琉基、輕基、酚基等。
    2.5 交聯法
    交聯法是利用雙功能基團試劑或多功能基團試劑使微生物發生分子間交聯而得到固定的一種方法。該方法生物反應活性損失大，且采用的交聯劑大都比較昂貴，因此應用受到一定的限制。常用交聯劑有戊二醛、雙重氮聯苯胺。
    2.6無載體固定法
    細胞自絮凝形成顆粒的一種固定化細胞的方法。這種方法操作簡單，微生物細胞的生理和生態環境不受外來物質的干擾，顆粒整體活性好，但內部結構疏松，結合不牢固。
 
    3固定化微生物技術在水產養殖中的應用
    3.1改善養殖水體環境
    由于環境污染日益嚴重，養殖水體的水質惡化，致使有害菌大量繁殖。在生產上，微生態制劑被廣泛用來改善養殖水體環境。選作微生態制劑菌種的有光合細菌、硝化細菌、芽胞桿菌、雙歧桿菌、酵母菌等，它們能吸收分解水中的氨氮、硫化氫、亞硝酸鹽等有害物質以及魚類產生的糞便和殘餌，提高養殖水體中的溶氧，調節水體的pH值，從而達到改善養殖水體環境的目的。但是游離態的有益微生物在惡劣的環境中很難存活并繁殖為優勢種群，容易被水流沖走、被其它生物所食，因此難以穩定地長期發揮作用。近年來，固定化細胞技術的興起,為微生物的應用增添了新的活力。
    鄭耀通，胡開輝（1999）采用凈化模擬養殖水質試驗表明：固定化光合細菌可顯著提高氨態氮和COD的去除率，并能增加溶解氧。Hisashi等比較了PVA和海藻酸2種材料固定化光合細菌對魚池水質凈化與反硝化的效果，結果表明固定化PVA球比海藻酸鹽固定化球的水質凈化能力強。黃正等富集、培養硝化細菌污泥，選用PVA作為載體，添加適量粉末活性炭包埋固定硝化細菌污泥,處理養殖廢水(COD=243 mg/L,NH4+—N= 45 mg/L)，處理24 h后COD去除率為74.9%，NH4+—N去除率達82.5%。Shan等利用固定化的硝化細菌去除對蝦養殖池中高濃度的氨氮,能有效去除養殖池中的總氨氮量高達20 mg/L，即使投入的固定化顆粒密度較小，也能獲得較高的總氨氮去除率。余林娟等（2004）以沙粒或沸石粉作為載體分別固定芽孢桿菌作為微生物治理劑,并將其應用于實驗蝦池和生產性蝦池中,以NH4+—N和NO2-—N含量作為指標判斷它們對蝦池水體水質的影響和控制，結果表明此類新型的固定化微生物治理劑具有穩定的生物效應，持續發揮作用，對蝦池亞硝酸鹽有明顯的去除控制效果。
    3.2提高魚種運輸成活率
    王立華（1997）通過密封魚簍運輸鯉魚魚種試驗發現：運輸鯉魚魚種過程中添加固定化光合細菌，可提高魚種成活率，其魚種成活率比游離光合細菌提高10.9%，比對照簍提高14%，顯示了較好的運輸效果。
    3.3提高魚苗育種的成活率
    鄭耀通，胡開輝（1999）經1個月的魚苗飼養試驗，固定化光合細菌組和游離光合細菌組魚體重顯著大于對照組，成活率也高于對照組，固定化光合細菌組效果最佳，不僅魚體質好，活潑，個體較大且整齊，體色鮮艷。其主要原因是固定化光合細菌能高效凈化水質，特別是能去除氨氮等有毒物質，從而減輕了對魚體的毒害作用，使魚體能維持正常的物質代謝。固定化光合細菌組優于游離菌組，前者不受流水和換水的影響，在使用前可清洗，消除了培養基影響水質的問題。王怡平（1999）研究發現固定化光合細菌在中華絨螯蟹人工育苗中也有重要的作用。
    3.4生態防病
    有益微生物被包埋載體固定化后，在微生物環境中占絕對優勢，由于其高效去除有機污染物而抑制了有害異養菌生長，間接地起到了防治魚病的作用。
 

                                                               編輯：王宇