中國水產門戶網報道摘 要 采用RAPD方法對大珠母貝中培育大型珍珠應用較多金唇(G)貝、銀唇(s)貝和黃唇(Y)貝3個養殖種群的分子遺傳學特性進行了研究。s、G和Y的多態位點比例 P分別是72.22％、75.56％和80.00％；G、s和Y的基因多樣性指數分別為0.2846、0.2891和0.2904。G種群基因多樣性指數和Shannon信息指數均高于其余2個種群；s種群的基因多樣性指數高于Y種群，但是其Shannon信息指數低于Y種群。3個種群兩兩間的遺傳一致性程度均較高，最低的是Y種群和s種群間的遺傳一致性，為0.8757，最高的是G種群和Y種群間的遺傳一致性，為0.9283，表明3個種群間，尤其是G和Y種
群間的親緣關系較近，這與它們間形態學上的相似性程度相一致。
　　關鍵詞  分子遺傳學  大珠母貝  養殖種群

    大珠母貝，又稱白蝶貝[Pinctada maxiln(Jameson)]，是最大型的一種養殖海水珍珠的貝類，最大個體殼高達30cm以上，體重大于5kg(王如才等，1993，)，是生產大型優質海水珍珠最理想的珍珠貝。大珠母貝培育的珍珠因具有珠大、珍珠質層厚和珍珠光澤豐富等優點而備受人們親睞，價值大大高于馬氏珠母貝培育的“南珠”。根據大珠母貝貝殼內表面外周珍珠質顏色的差異，可以分為金唇(Gold-lip，G)貝、銀唇(Silver-lip，s)貝和黃唇(Yellow-lip，Y)貝等。金唇貝生產的金色珍珠價值最高，銀唇貝生產的銀白色珍珠價格不菲，而南黃唇貝生產的黃色珍珠價值遠遠低于上述兩種珍珠。澳大利亞和印度尼西亞的大珠母貝養殖較發達，形成了金唇貝、銀唇貝和黃唇貝等不同養殖種群，不同種群生產珍珠所產生的價值的差異使我們意識到有必要從分子生物學水平探討這些種群的遺傳差異和建立分子判別方法。
    隨機擴增片段長度多態性(randomly amplified polymorphic DNA，RAPD)已被廣泛地應用于陸生動物研究。近幾年來，該技術被用于從核酸分子水平上對魚、蝦、貝等主要水產生物的親緣關系及其演化過程的研究，但是主要研究對象是魚類(Bardakci and Skibinski。1999；Zhou et a1.，2000a,h)，對其它海洋動物尤其是珍珠貝的研究較少。本文自印度尼兩亞取不同養殖種群大珠母貝的閉殼肌為材料，采用RAPD技術，對種群內和不同種群間的遺傳多樣性和遺傳距離進行了初步研究。

　　1　材料和方法

    1.1  材料
    大珠母貝的三個養殖種群G、S、Y均取自于印度尼西亞，三個種群取材樣本數分別為49、50和50個。取新鮮的大珠母貝閉殼肌，70％乙醇固定2小時，換用95％的乙醇，2-4小時后再換一次95％乙醇，于-20℃保存備用。
    1.2 實驗方法
    1.2.1 基因組DNA的提取
    每個樣品稱取0.2 g閉殼肌，0.8％生理鹽水漂洗，剪成細末，置于1.5ml離心管中，加入0.5ml STE[10 mmol／L Tris.HCl、PH 8.0，1 mmol／L EDTA(PH 8.0)，1 0 0 mmol／L NaCll、65斗l 10％的SDS和6μl蛋白酶k(10mg/m1)，  顛倒混勻，55℃保溫消化4—6小時，消化過程中每30分鐘顛倒混勻一次。待肌肉消化完全后依次以等體積酚／氯仿(酚：氯仿：異戊醇=2 5：2 4：1)和氯仿／異戊醇(氯仿：異戊醇=24：1)各抽提2次，然后加入2倍體積的無水乙醇室溫沉淀DNA 30分鐘以上，70％的乙醇洗滌沉淀2次，DNA沉淀于室溫干燥15分鐘后溶于25μl滅菌雙蒸水，取1μl瓊脂糖凝膠電泳，檢測DNA質量和估計濃度，其余DNA置-20℃備用。
    1.2.2  RAPD擴增
    PCR主要參照Williams等(1990)，對各參數適當調整優化。擴增反應總體積15-25μl。其中包括1×擴增緩沖液(10 mmol／L Tris.HCl、PH 8.3，50 mmolfL KCl，0.001％明膠)，200μmol／L的dNTPs，RAPD引物0.2μmol／L，MgCl220mmol／L，IU Taq DNA聚合酶，15～200 ng基因組DNA。擴增參數為：94℃預變性4 min；94℃ 30See，36℃ 30 Sec，72℃ 1 min 30 Sec，45個循環；72℃延伸5 min。
    1.2.3 電泳觀察
    擴增產物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離(1×TBE，3V／cm恒壓)，EB染色，凝膠成像系統觀察和拍照。
    1.2.4 數據分析
統計各個樣品的擴增帶，轉換為0(無帶)、1(有帶)數據，將(0、1)矩列數據輸人計算機，用PopGen 32生物軟件進行處理。將RAPD標記作為等位基因，計算各種群的多態位點比例P、種群內的遺傳多樣性值和種群問的遺傳距離等。P=多態性擴增片段數，擴增片段總數；種群內的遺傳多樣性值D=I-Sxy，遺傳相似性指數Sxy=2 Nxy／(Nx+Ny)，相對遺傳距離Dxy=-ln(Sxy／Sx·Sy)，其中Nxy是個體x和個體y共有位點數，Nx和 Nv分別是個體x和個體y共擴增出位點數。群體內的相似性指數為此群體內所有個體間相似性指數的平均值，群體問的相似性指數為兩群體任意兩個體的相似性指數的平均數。Sxy為兩群體問的相似性指數，sx，sy分別表示群體x和群體Y的相似性指數(Nei，1972，1973)。Shannon信息指數(Shannon's Information index)按照公式H=-∑πilnπi/N計算，其中，πi為某一條帶在群體中出現的頻率，ln為自然對數，N為群體總的位點數(Wachia et al.,1995)

　　2　結果

    2.1 引物篩選和RAPD圖譜分析
    購自于大不列顛哥倫比亞大學(the University 0f British Columbia)的RAPD set#1的100條引物和購自博亞生物技術有限公司(上海)的編號為BA0001-BA0200的200條RAPD引物進行了篩選，分別獲得了0008，0011，0090，0091，0092，0096和BA0029，BA0033，BA0045， BA0093，BA0097，BA0105，BA0108，BA0156，BA0158，BA0197共16條能夠在各個群體中都能夠擴增清晰出帶紋的的隨機引物。



    16條引物在各個體中擴增的片段數在2-12條之間，片段大小位于0.2-3.5 kh，主要集中于0.5Kb-2.0 kb(圖1顯示)。個體之間和群體之間的擴增都存在差異，沒有兩個個體的擴增結果完全相同，反映了各個體問基因組成存在一定的差別，同時顯示RAPD具有較高的分辨率。3個大珠母貝種群共檢測到90個位點，其中，多態性位點數分別為G 68個，S 65個。Y 72個，多態位點比例P由大到小順序依次為：PY>P>c Ps；對三個種群總體而言，90個位點僅有5個完全相同，位點多態性為94.4％(表1)。
    2.2 遺傳分析
    三個大珠母貝種群內的基因多樣性指數和Shannon信息指數見表2。結果顯示，無論是基因多樣性指數還是Shannon信息指數，G種群的值都要高于其余2個種群；s和Y種群由于計算方法不同結果存在差異，s種群的基因多樣性指數高于Y種群，但是其 Shannon信息指數低于Y種群。


注：對角線以上為種群問遺傳相似性，對角線以下為種群問遺傳距離。

    種群問的遺傳分析(表2)結果表明，三個種群兩兩問的遺傳一致性程度均較高，最低的是Y種群和S種群問的遺傳一致性，為0.8757，最高的是G種群和Y種群問的遺傳一致性，為0.9283。S種群同G和Y種群問的遺傳距離較大，分別為0.1315和0.1328，幾乎相同；G和Y種群問的遺傳距離較小，為0.0744。

　　3　討論

  3.1  大珠母貝種群內的遺傳多樣性比較
  大珠母貝三個養殖種群的多態位點比例都很高，其范圍在72.22％-80.00％之間，其中黃唇貝Y最高，暗示絕大多數RAPD位點在各個種群內都還沒有完全純合。此外，無論是N。i基因多樣性還是Shannon信息指數，各養殖群體的值都較高，分別處0.2846-0.291M和0.4224—0.4257范圍間，也表明種群內個體問具有較大的遺傳差異，遺傳多樣性程度比較高。馬氏珠母貝的研究表明(王愛民、鄧鳳嬌等，2000；王愛民、閻冰等2003)，馬氏珠母貝野生種群內的遺傳多樣性較高，Nei基因多樣性值在0.312-0.4134問，而養殖群體內個體差異較小，Nei基因多樣性值僅有0.284，與本研究結果相似。大珠母貝養殖群體遺傳多樣性與馬氏珠母貝養殖群體相似，可能暗示大珠母貝的野生種群和養殖種群的遺傳多樣性特征與馬氏珠母貝相似：野生種群的遺傳多樣性原本較高，但是由于人工繁殖，親本數量的局限、非隨機交配和多代選育，導致了遺傳多樣性降低。進一步對大珠母貝野生種群的研究有助于闡明其同養殖種群的遺傳多樣性關系。
    盡管金唇貝G的位點多樣性比例較黃唇貝Y低，但是，G的Nei基岡多樣性和Shannon信息指數均較其余2個種群高，原因可能在于G群體中在較多個體中得以體現的多態位點比例比s種群和Y種群高。S種群的Nei基因多樣性值較Y種群高，然而，s種群的Shannon信息指數卻比Y種群低，這種同一原始數據通過不同的計算方法得出的結果的不一致性，一方面表明S種群和Y種群的種群內遺傳多樣性程度需要更多的分子標記方法和數據分析處理方法才能夠比較與確定，另一方面，暗示數據的生物統計分析理論和方法有待于進一步完善。
    3.2 大珠母貝種群間的遺傳相似性和遺傳距離比較
    3個大珠母貝種群兩兩問的遺傳一致性都很高，大于0.8757，表明它們問的親緣關系很近，在大珠母貝的分子進化過程中的分化發生較晚。形態學性狀上，3個種群除了在貝殼內表面唇的色澤存在差異外，其余性狀很難彼此區分，即形態學性狀的一致性很高，這與本文在核酸分子水平上的研究結果一致。
    在色澤上，金色唇和黃色唇更接近，而白色唇與二者的差異則要明顯得多。G種群和Y種群問的遺傳距離最低；G種群和Y種群各自與S種群問的遺傳距離相對較大，而且這種遺傳距離差異大約相同，分別為0.1315和0.1328。表明G種群和Y種群問的親緣關系最近，二者的共同祖先類群與銀唇貝分離后，以相似的演化速度形成了現在的金唇貝和黃唇貝。

主要參考文獻
l、王如才，王昭萍，張建中。海水貝類養殖學。青島：青島海洋大學出版社，1993P208—209
2、王愛民、鄧鳳嬌、張錫元、閻冰葉力，毛勇，張木先.馬氏珠母貝遺傳多樣性的RAPD分析。武漢大學學報.2000，46(4)：467—470
3、王愛民、閻冰、葉力、鄧鳳嬌、張錫元、武波。三個野生種群馬氏珠母貝遺傳多樣性的RAPD研究。農業生物技術學報，2003，11(2)：163—168
4、Bardakci，F，Skibinski DO.A polymorphic SCAR—RAPD marker between species()f tilapia(Pisees：Ciehlidae).Anim Genet,1 999，30：78—9.
5、Nei M.Genetic distance between populations.Am Nat,1972.106：283—292.

作者簡介
石耀華，1970年10月，海南大學海洋學院，副教授，主要從事水牛動物遺傳、育種和發育等領域研究，海南省海口市人民路58號，郵編：570228，電話：0898—68263920；  e—mail：slone70@sina.com ,通訊作者：王愛民，aimwang6@hotmail.com 

（石耀華  王嫣  王愛民  顧志峰）