摘要 原位雜交技術(shù)是近年來快速發(fā)展起來的一門新技術(shù)。本文介紹了原位雜交技術(shù)的基本原理和幾種常用的原位雜交技術(shù)，并概述了原位雜交技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用現(xiàn)狀，包括該技術(shù)在基因定位、性別鑒定和病毒檢測等領(lǐng)域的應(yīng)用。此外，還對(duì)該技術(shù)的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

　　關(guān)鍵詞 原位雜交 水產(chǎn)養(yǎng)殖 染色體

　　原位雜交技術(shù)(In situ hybridization，ISH)是分子生物學(xué)、組織化學(xué)及細(xì)胞學(xué)相結(jié)合而產(chǎn)生的一門新興技術(shù)，始于20世紀(jì)60年代。1969年美國耶魯大學(xué)的Gall等(1969)首先用爪蟾核糖體基因探針與其卵母細(xì)胞雜交，將該基因進(jìn)行定位，與此同時(shí)Buongiorno-Nardelli和Amaldi等(1970)相繼利用同位素標(biāo)記核酸探針進(jìn)行了細(xì)胞或組織的基因定位，從而創(chuàng)造了原位雜交技術(shù)。自此以后，由于分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，特別是20世紀(jì)70年代末到80年代初，分子克隆、質(zhì)粒和噬菌體DNA的構(gòu)建成功，為原位雜交技術(shù)的發(fā)展奠定了深厚的技術(shù)基礎(chǔ)。

　　1 原位雜交的基本原理

　　原位雜交技術(shù)的基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補(bǔ)的堿基序列，將有放射性或非放射性的外源核酸(即探針)與組織、細(xì)胞或染色體上待測DNA或RNA互補(bǔ)配對(duì)，結(jié)合成專一的核酸雜交分子，經(jīng)一定的檢測手段將待測核酸在組織、細(xì)胞或染色體上的位置顯示出來。為顯示特定的核酸序列必須具備3個(gè)重要條件：組織、細(xì)胞或染色體的固定、具有能與特定片段互補(bǔ)的核苷酸序列(即探針)、有與探針結(jié)合的標(biāo)記物(曾呈奎等)

　　1．1 組織、細(xì)胞或染色體的固定

　　在染色體原位雜交中要求染色體分散良好、長度稍長、無單體分離。在固定劑的選擇和應(yīng)用方面要兼顧3個(gè)方面：(1)保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)。(2)最大限度地保持細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA的水平。(3)使探針易于進(jìn)入細(xì)胞或組織。一般認(rèn)為DNA是比較穩(wěn)定的，mRNA是相對(duì)穩(wěn)定且易被酶合成和降解，RNA卻非常容易被降解。因此對(duì)于DNA的定位來說，固定劑的種類和濃度并不十分重要，相反在RNA定位上，如果要使RNA的降解減少到最低限度，不僅要考慮固定劑的種類和濃度，而且取材后應(yīng)盡快予以冷凍或固定。在固定劑中，最常用的是多聚甲醛。與其他的固定劑(如戊二醛)不同，多聚甲醛不會(huì)與蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，因而不會(huì)影響探針穿透進(jìn)入細(xì)胞或組織。其他如醋酸-酒精混合液和Bouin’S固定劑也能獲得較滿意的結(jié)果。在實(shí)際操作過程中，常需要加入較強(qiáng)的增強(qiáng)組織通透性的試劑，如：應(yīng)用酒精或某些消化酶如胃蛋白酶、淀粉酶等，可增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性，提高雜交信號(hào)，但同時(shí)也會(huì)減低RNA的保存和影響組織結(jié)構(gòu)的形態(tài)，因此在用量及孵育時(shí)間上應(yīng)小心掌握。至今多聚甲醛仍被公認(rèn)為原位雜交中比較理想的固定劑。

　　1．2 探針的類型及發(fā)展

　　探針是原位雜交中用于細(xì)胞內(nèi)特定DNA或mRNA序列定位的一段特定的核酸序列。根據(jù)探針的核酸性質(zhì)的不同可分為DNA探針和RNA探針兩大類。早期應(yīng)用的主要是DNA探針，在DNA探針的選擇上應(yīng)盡量選有編碼序列(外元)的DNA片段作為探針，避免使用內(nèi)元和其他非編碼序列。20世紀(jì)70年代Temin等(1971)在研究致癌RNA病毒時(shí)制備了cDNA探針，其基本原理是以mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下產(chǎn)生的。cDNA中不含內(nèi)元和其他重復(fù)序列，是較為理想的核酸探針，但制備困難。RNA探針是將特異性的cDNA片段插入含有相當(dāng)?shù)腞NA聚合酶啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄性載體。通過改變外源基因的插入方向可以控制RNA的轉(zhuǎn)錄方向，即以哪條DNA鏈為模板轉(zhuǎn)錄RNA，從而可以得到與mRNA同序列的同義RNA探針和與mRNA互補(bǔ)的反義RNA探針。DNA合成儀的誕生使人工合成寡核苷酸成為可能，與上述探針不同的是寡核苷酸探針不是克隆性DNA探針，它是由DNA合成儀依照所需雜交的靶核苷酸序列合成的，具有制造方便、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，但其特異性不如克隆性探針強(qiáng)，雜交信號(hào)也較弱。

　　1．3 核酸探針標(biāo)記的方法

　　隨著原位雜交技術(shù)的發(fā)展，標(biāo)記核酸探針的方法從使用放射性的標(biāo)記物到應(yīng)用非放射性的標(biāo)記物(Raybum et al．1985)檢測的靈敏度越來越高，并且應(yīng)用的范圍也越來越廣泛。最初的原位雜交是利用具有放射性的探針檢測細(xì)胞中特定基因在染色體上的位置和表達(dá)，例如使用。3H 、32P和35S等放射性同位素標(biāo)記探針。放射性同位素標(biāo)記探針對(duì)樣品要求不太嚴(yán)格并且靈敏度高，但是對(duì)雜交信號(hào)的分析存在許多缺點(diǎn)，如每次檢測均需重新標(biāo)記探針，檢測時(shí)間長，信號(hào)分辨率低等(呂忠進(jìn)等1993；奇文清等1996)。此外，用同位素標(biāo)記的探針具有放射性，既污染環(huán)境又對(duì)人體有害，且受到半衰期的限制等缺點(diǎn)，人們開始探索用非放射性的標(biāo)記物標(biāo)記核酸探針進(jìn)行原位雜交。Bauman等(1981)首先應(yīng)用熒光素標(biāo)記eRNA探針做原位雜交，然后用熒光顯微鏡觀察獲得成功。隨著生物素和地高辛標(biāo)記探針技術(shù)的建立，更加豐富了核酸探針的標(biāo)記方法。生物素標(biāo)記技術(shù)是利用生物素標(biāo)記的探針在組織切片上檢測病毒DNA，通過生物素與抗生素的結(jié)合，過氧化物酶一抗過氧化物酶顯示系統(tǒng)顯示病毒DNA在細(xì)胞中的定位。近年來，地高辛(Digoxingonin)標(biāo)記技術(shù)日漸興起，越來越受到科研工作者的青睞。和其他非放射性標(biāo)記物一樣，地高辛標(biāo)記系統(tǒng)安全、方便、節(jié)省時(shí)間，同時(shí)在敏感性和質(zhì)量控制方面比生物素標(biāo)記技術(shù)優(yōu)越，可以檢測出人基因組DNA中的單拷貝基因。地高辛標(biāo)記探針技術(shù)目前已被廣泛應(yīng)用，特別是在病毒學(xué)和病理學(xué)的臨床診斷中。

　　2 幾種原位雜交技術(shù)

　　2．1 基因組原位雜交技術(shù)

　　基因組原位雜交(Genome in situ hybridization，GISH)技術(shù)是20世紀(jì)80年代末發(fā)展起來的一種原位雜交技術(shù)。它主要是利用物種之間DNA同源性的差異，用另一物種的基因組DNA以適當(dāng)?shù)臐舛茸鞣庾瑁�在靶染色體上進(jìn)行原位雜交。GISH技術(shù)最初應(yīng)用于動(dòng)物方面的研究(Pinkel et a1．1986)，在植物上最早應(yīng)用于小麥雜種和栽培種的鑒定(余舜武等 2001；王文奎等 2000)。

　　2．2 熒光原位雜交技術(shù)

　　熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)是在已有的放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性DNA分子原位雜交技術(shù)。它利用熒光標(biāo)記的核酸片段為探針，與染色體上或DNA顯微切片上的特異片斷進(jìn)行雜交，通過熒光檢測系統(tǒng)(熒光顯微鏡)檢測信號(hào)DNA序列在染色體或DNA顯微切片上的目的DNA序列，進(jìn)而確定其雜交位點(diǎn)。FISH技術(shù)檢測時(shí)間短，檢測靈敏度高，無污染，已廣泛應(yīng)用于染色體的鑒定、基因定位和異常染色體檢測等領(lǐng)域。

　　2．3 多彩色熒光原位雜交技術(shù)

　　多彩色熒光原位雜交(Multicolor fluorescence in situ hybridization，mFISH)是在熒光原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新技術(shù)，它用幾種不同顏色的熒光素單獨(dú)或混合標(biāo)記的探針進(jìn)行原位雜交，能同時(shí)檢測多個(gè)靶位，各靶位在熒光顯微鏡下和照片上的顏色不同，呈現(xiàn)多種色彩，因而被稱為多彩色熒光原位雜交。它克服了FISH技術(shù)的局限，能同時(shí)檢測多個(gè)基因，在檢測遺傳物質(zhì)的突變和染色體上基因定位等方面得到了廣泛的應(yīng)用(楊明杰等1998)。

　　2．4 原位PCR

　　原位PCR技術(shù)是常規(guī)的原位雜交技術(shù)與PCR技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，即通過PCR技術(shù)對(duì)靶核酸序列在染色體上或組織細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行原位擴(kuò)增使其拷貝數(shù)增加，然后通過原位雜交技術(shù)進(jìn)行檢測，從而對(duì)靶核酸序列進(jìn)行定性、定位和定量分析。原位PCR技術(shù)大大提高了原位雜交技術(shù)的靈敏度和專一性，可用于低拷貝甚至單拷貝的基因定位，為原位雜交技術(shù)的發(fā)展提供了更廣闊的發(fā)展前景。

　　3 原位雜交技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用

　　3．1 基因定位

　　原位雜交技術(shù)應(yīng)用最成功的是基因定位，基因定位研究是構(gòu)建基因圖譜的基本要素。在魚類中，原位雜交技術(shù)主要用于特異重復(fù)DNA的定位(李 奎等 1995)、多拷貝基因的定位(Smith el a1．1990)和魚類染色體特異探針的制備與應(yīng)用(Phillips el a1．1996)。Pendas等(1994b)利用熒光原位雜交技術(shù)對(duì)鮭、鱒和虹鱒的組蛋白基因簇進(jìn)行了定位，結(jié)果表明，組蛋白基因在這幾種魚中只有一個(gè)位點(diǎn)。Gornung等(1997)以18s rRNA基因?yàn)樘结槍?duì)杜氏鰤魚(Seriola dumerili)進(jìn)行了熒光原位雜交分析，得到的結(jié)果與通過銀染和色霉素染色得到的NOR位點(diǎn)相吻合，而且所有的NOR順反子都是有活性的。王澤群等(1999)采用地高辛標(biāo)記鯉魚基因組DNA重復(fù)序列CRI對(duì)興國紅鯉的染色體進(jìn)行原位雜交，發(fā)現(xiàn)CRI的雜交信號(hào)主要分布在一些染色體的著絲粒區(qū)。翁幼竹等(2000)用地高辛標(biāo)記的寡核苷酸探針對(duì)GnRH受體在文昌魚神經(jīng)系統(tǒng)、哈氏窩和性腺中的定位和表達(dá)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)細(xì)胞、尤其是在中腦右側(cè)延伸出與哈氏窩相接觸的漏斗樣結(jié)構(gòu)中的神經(jīng)細(xì)胞、哈氏窩上皮細(xì)胞以及雌、雄性腺中生殖細(xì)胞都有GnRH受體mRNA雜交信號(hào)，信號(hào)物質(zhì)分布于胞質(zhì)，胞核為陰性。在貝類方面，Clabby等(1996)通過熒光原位雜交技術(shù)，將衛(wèi)星DNA Cg170定位到原位雜交技術(shù)及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用牡蠣的兩對(duì)染色體的端粒和亞端粒區(qū)域，但沒有指明定位的特異染色體，后來王永平等(2O01)將此衛(wèi)星序列重新定位在長牡蠣染色體的著絲粒處。在整個(gè)雙殼貝類甚至在整個(gè)貝類中Cgl70可能是第一個(gè)定位到牡蠣著絲點(diǎn)區(qū)域的衛(wèi)星序列。此外，還將牡蠣核糖體rDNA定位到長目力的第10對(duì)染色體上和美洲牡蠣的第2對(duì)染色體上(wang et al．2000、2001)。在斧蛤，報(bào)道了一個(gè)以160 bp為重復(fù)單位的衛(wèi)星DNA家族，這個(gè)家族的脊椎動(dòng)物端粒序列已經(jīng)被定位到所有染色體的端粒區(qū)域(Plohl et a1．1997)，在貽貝報(bào)道了一個(gè)以173 bp為重復(fù)單位的衛(wèi)星序列，約占基因組的0.6% (Ruiz et a1．1992)。李 奎等(1995)用地高辛標(biāo)記原位雜交技術(shù)將黃膳的rRNA基因定位于二價(jià)染色體的3q12-q14和7q14-q26位置上。

　　3.2 性別鑒定

　　性別控制對(duì)加快選種進(jìn)程，提高經(jīng)濟(jì)效益有著非常重要的作用。魚類的性別類型多(XX／XY、

　　XX／XO、ZW／ZZ、ZO／ZZ)性別鑒定系統(tǒng)比較復(fù)雜。Nakayama等(1994)通過消減克隆的方法對(duì)兔脂鯉魚的基因組DNA進(jìn)行了檢測，從10個(gè)插入克隆中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)克隆存在性別特異性的模式。通過原位雜交發(fā)現(xiàn)，在24個(gè)個(gè)體中有21個(gè)個(gè)體具有與其性別相符合的染色體特征和雜交模式，1個(gè)雌魚具有雄魚的特征，兩個(gè)雄魚具有雌魚的染色體特征和雜交模式，這3個(gè)非典型個(gè)體可能是由于Z染色體和w染色體區(qū)域間的基因交換造成的。Iturra等(1998)以900 bp的探針結(jié)合RAPD分析確定了虹鱒的性染色體分子標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)在一個(gè)形態(tài)上似Y染色體的染色體上具有一個(gè)明顯的RAPD信號(hào)，這一發(fā)現(xiàn)對(duì)于這一種類的性別決定具有重大的意義。

　　3．3 病毒檢測及診斷

　　原位雜交技術(shù)是分子生物學(xué)與組織化學(xué)相結(jié)合的一種技術(shù)，它從細(xì)胞水平上在原位研究特異核酸的分布、數(shù)量以及細(xì)胞分化、生理、病理狀態(tài)、形態(tài)特征演化之間的關(guān)系(呂玲等2000)。由于原位雜交能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行單一細(xì)胞的研究而不受同一組織中其他成分的影響，而且不需要從組織中提取核酸，而對(duì)于組織中含量極低的外源染色體片段有極高的敏感性，因此，此技術(shù)自1993年以來廣泛應(yīng)用于對(duì)蝦病毒的檢測以及對(duì)蝦病毒病的診斷。較早的是Bruce等(1994)利用此技術(shù)檢測感染桿狀病毒(BP)的對(duì)蝦的各種器官。在國內(nèi)，雷質(zhì)文等(2001、2002)用PCR法制備地高辛標(biāo)記的探針，采用原位雜交技術(shù)對(duì)中國對(duì)蝦和克氏原鰲蝦體內(nèi)的白斑綜合征病毒(WSSV)進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明，此技術(shù)在對(duì)蝦暴發(fā)性流行病的診斷方面具有很高的應(yīng)用價(jià)值。呂玲等(2000)采用原位雜交對(duì)對(duì)蝦的白斑綜合征病毒的組織特異性進(jìn)行了檢測，所得到的陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)比HE多，而且探針的敏感性隨探針長度的增加而降低。鄧敏等(2000)運(yùn)用建立的WSSV部分基因組文庫，將WSSV EcoR I克隆片段標(biāo)記制備為探針，進(jìn)行原位雜交，其結(jié)果證明了克隆片段對(duì)WSSV的特異性，并為檢測WSSV提供了方法。

　　3.4 其他方面的應(yīng)用

　　原位雜交技術(shù)除了在上述方面的應(yīng)用之外，在檢測藥物耐藥性方面也得到了應(yīng)用。楊漢春等(2001)、趙靜等(1999)以隨機(jī)引物法，用地高辛標(biāo)記制備成探針，成功建立了菌落原位雜交法用于檢測豬源大腸桿菌和豬源大腸埃希氏菌對(duì)卡那霉素和四環(huán)素抗藥性的研究，結(jié)果表明與藥敏試驗(yàn)的陽性符合率分別為100％和91.7%。

　　4 展望

　　綜上所述，原位雜交技術(shù)因其高度的靈敏性和準(zhǔn)確性而日益受到許多科研工作者的歡迎，并廣泛應(yīng)用到基因定位、性別鑒定和基因圖譜的構(gòu)建等研究領(lǐng)域。目前原位雜交技術(shù)在植物中的應(yīng)用比較廣泛，例如在棉花、麥類和樹木等的遺傳育種方面取得了顯著的成就，在畜牧上原位雜交技術(shù)主要用于基因定位和基因圖譜的構(gòu)建以及轉(zhuǎn)基因的檢測和性別鑒定等方面。在水產(chǎn)方面，原位雜交技術(shù)則主要應(yīng)用于基因定位(多見于對(duì)魚類和貝類等水生物的研究)和病毒的檢測(多見于蝦類)。此外，原位雜交技術(shù)做為染色體高分辨顯帶技術(shù)的補(bǔ)充和發(fā)展，在水生物的細(xì)胞遺傳學(xué)的研究領(lǐng)域?qū)�發(fā)揮更重要的作用。同其他的生物技術(shù)一樣，原位雜交技術(shù)在其發(fā)展與應(yīng)用的過程中會(huì)出現(xiàn)一些問題，但隨著原位雜交技術(shù)的不斷改進(jìn)與完善以及檢測手段的改進(jìn)，原位雜交技術(shù)的優(yōu)越性越來越突出，其應(yīng)用也會(huì)更加廣泛。