摘要 原位雜交技術是近年來快速發展起來的一門新技術。本文介紹了原位雜交技術的基本原理和幾種常用的原位雜交技術，并概述了原位雜交技術在水產養殖中的應用現狀，包括該技術在基因定位、性別鑒定和病毒檢測等領域的應用。此外，還對該技術的應用前景進行了展望。

　　關鍵詞 原位雜交 水產養殖 染色體

　　原位雜交技術(In situ hybridization，ISH)是分子生物學、組織化學及細胞學相結合而產生的一門新興技術，始于20世紀60年代。1969年美國耶魯大學的Gall等(1969)首先用爪蟾核糖體基因探針與其卵母細胞雜交，將該基因進行定位，與此同時Buongiorno-Nardelli和Amaldi等(1970)相繼利用同位素標記核酸探針進行了細胞或組織的基因定位，從而創造了原位雜交技術。自此以后，由于分子生物學技術的迅猛發展，特別是20世紀70年代末到80年代初，分子克隆、質粒和噬菌體DNA的構建成功，為原位雜交技術的發展奠定了深厚的技術基礎。

　　1 原位雜交的基本原理

　　原位雜交技術的基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基序列，將有放射性或非放射性的外源核酸(即探針)與組織、細胞或染色體上待測DNA或RNA互補配對，結合成專一的核酸雜交分子，經一定的檢測手段將待測核酸在組織、細胞或染色體上的位置顯示出來。為顯示特定的核酸序列必須具備3個重要條件：組織、細胞或染色體的固定、具有能與特定片段互補的核苷酸序列(即探針)、有與探針結合的標記物(曾呈奎等)

　　1．1 組織、細胞或染色體的固定

　　在染色體原位雜交中要求染色體分散良好、長度稍長、無單體分離。在固定劑的選擇和應用方面要兼顧3個方面：(1)保持細胞結構。(2)最大限度地保持細胞內DNA或RNA的水平。(3)使探針易于進入細胞或組織。一般認為DNA是比較穩定的，mRNA是相對穩定且易被酶合成和降解，RNA卻非常容易被降解。因此對于DNA的定位來說，固定劑的種類和濃度并不十分重要，相反在RNA定位上，如果要使RNA的降解減少到最低限度，不僅要考慮固定劑的種類和濃度，而且取材后應盡快予以冷凍或固定。在固定劑中，最常用的是多聚甲醛。與其他的固定劑(如戊二醛)不同，多聚甲醛不會與蛋白質產生廣泛的交叉連接，因而不會影響探針穿透進入細胞或組織。其他如醋酸-酒精混合液和Bouin’S固定劑也能獲得較滿意的結果。在實際操作過程中，常需要加入較強的增強組織通透性的試劑，如：應用酒精或某些消化酶如胃蛋白酶、淀粉酶等，可增強組織的通透性和核酸探針的穿透性，提高雜交信號，但同時也會減低RNA的保存和影響組織結構的形態，因此在用量及孵育時間上應小心掌握。至今多聚甲醛仍被公認為原位雜交中比較理想的固定劑。

　　1．2 探針的類型及發展

　　探針是原位雜交中用于細胞內特定DNA或mRNA序列定位的一段特定的核酸序列。根據探針的核酸性質的不同可分為DNA探針和RNA探針兩大類。早期應用的主要是DNA探針，在DNA探針的選擇上應盡量選有編碼序列(外元)的DNA片段作為探針，避免使用內元和其他非編碼序列。20世紀70年代Temin等(1971)在研究致癌RNA病毒時制備了cDNA探針，其基本原理是以mRNA為模板，在逆轉錄酶的作用下產生的。cDNA中不含內元和其他重復序列，是較為理想的核酸探針，但制備困難。RNA探針是將特異性的cDNA片段插入含有相當的RNA聚合酶啟動子的轉錄性載體。通過改變外源基因的插入方向可以控制RNA的轉錄方向，即以哪條DNA鏈為模板轉錄RNA，從而可以得到與mRNA同序列的同義RNA探針和與mRNA互補的反義RNA探針。DNA合成儀的誕生使人工合成寡核苷酸成為可能，與上述探針不同的是寡核苷酸探針不是克隆性DNA探針，它是由DNA合成儀依照所需雜交的靶核苷酸序列合成的，具有制造方便、價格低廉等優點，但其特異性不如克隆性探針強，雜交信號也較弱。

　　1．3 核酸探針標記的方法

　　隨著原位雜交技術的發展，標記核酸探針的方法從使用放射性的標記物到應用非放射性的標記物(Raybum et al．1985)檢測的靈敏度越來越高，并且應用的范圍也越來越廣泛。最初的原位雜交是利用具有放射性的探針檢測細胞中特定基因在染色體上的位置和表達，例如使用。3H 、32P和35S等放射性同位素標記探針。放射性同位素標記探針對樣品要求不太嚴格并且靈敏度高，但是對雜交信號的分析存在許多缺點，如每次檢測均需重新標記探針，檢測時間長，信號分辨率低等(呂忠進等1993；奇文清等1996)。此外，用同位素標記的探針具有放射性，既污染環境又對人體有害，且受到半衰期的限制等缺點，人們開始探索用非放射性的標記物標記核酸探針進行原位雜交。Bauman等(1981)首先應用熒光素標記eRNA探針做原位雜交，然后用熒光顯微鏡觀察獲得成功。隨著生物素和地高辛標記探針技術的建立，更加豐富了核酸探針的標記方法。生物素標記技術是利用生物素標記的探針在組織切片上檢測病毒DNA，通過生物素與抗生素的結合，過氧化物酶一抗過氧化物酶顯示系統顯示病毒DNA在細胞中的定位。近年來，地高辛(Digoxingonin)標記技術日漸興起，越來越受到科研工作者的青睞。和其他非放射性標記物一樣，地高辛標記系統安全、方便、節省時間，同時在敏感性和質量控制方面比生物素標記技術優越，可以檢測出人基因組DNA中的單拷貝基因。地高辛標記探針技術目前已被廣泛應用，特別是在病毒學和病理學的臨床診斷中。

　　2 幾種原位雜交技術

　　2．1 基因組原位雜交技術

　　基因組原位雜交(Genome in situ hybridization，GISH)技術是20世紀80年代末發展起來的一種原位雜交技術。它主要是利用物種之間DNA同源性的差異，用另一物種的基因組DNA以適當的濃度作封阻，在靶染色體上進行原位雜交。GISH技術最初應用于動物方面的研究(Pinkel et a1．1986)，在植物上最早應用于小麥雜種和栽培種的鑒定(余舜武等 2001；王文奎等 2000)。

　　2．2 熒光原位雜交技術

　　熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)技術是在已有的放射性原位雜交技術的基礎上發展起來的一種非放射性DNA分子原位雜交技術。它利用熒光標記的核酸片段為探針，與染色體上或DNA顯微切片上的特異片斷進行雜交，通過熒光檢測系統(熒光顯微鏡)檢測信號DNA序列在染色體或DNA顯微切片上的目的DNA序列，進而確定其雜交位點。FISH技術檢測時間短，檢測靈敏度高，無污染，已廣泛應用于染色體的鑒定、基因定位和異常染色體檢測等領域。

　　2．3 多彩色熒光原位雜交技術

　　多彩色熒光原位雜交(Multicolor fluorescence in situ hybridization，mFISH)是在熒光原位雜交技術的基礎上發展起來的一種新技術，它用幾種不同顏色的熒光素單獨或混合標記的探針進行原位雜交，能同時檢測多個靶位，各靶位在熒光顯微鏡下和照片上的顏色不同，呈現多種色彩，因而被稱為多彩色熒光原位雜交。它克服了FISH技術的局限，能同時檢測多個基因，在檢測遺傳物質的突變和染色體上基因定位等方面得到了廣泛的應用(楊明杰等1998)。

　　2．4 原位PCR

　　原位PCR技術是常規的原位雜交技術與PCR技術的有機結合，即通過PCR技術對靶核酸序列在染色體上或組織細胞內進行原位擴增使其拷貝數增加，然后通過原位雜交技術進行檢測，從而對靶核酸序列進行定性、定位和定量分析。原位PCR技術大大提高了原位雜交技術的靈敏度和專一性，可用于低拷貝甚至單拷貝的基因定位，為原位雜交技術的發展提供了更廣闊的發展前景。

　　3 原位雜交技術在水產養殖中的應用

　　3．1 基因定位

　　原位雜交技術應用最成功的是基因定位，基因定位研究是構建基因圖譜的基本要素。在魚類中，原位雜交技術主要用于特異重復DNA的定位(李 奎等 1995)、多拷貝基因的定位(Smith el a1．1990)和魚類染色體特異探針的制備與應用(Phillips el a1．1996)。Pendas等(1994b)利用熒光原位雜交技術對鮭、鱒和虹鱒的組蛋白基因簇進行了定位，結果表明，組蛋白基因在這幾種魚中只有一個位點。Gornung等(1997)以18s rRNA基因為探針對杜氏鰤魚(Seriola dumerili)進行了熒光原位雜交分析，得到的結果與通過銀染和色霉素染色得到的NOR位點相吻合，而且所有的NOR順反子都是有活性的。王澤群等(1999)采用地高辛標記鯉魚基因組DNA重復序列CRI對興國紅鯉的染色體進行原位雜交，發現CRI的雜交信號主要分布在一些染色體的著絲粒區。翁幼竹等(2000)用地高辛標記的寡核苷酸探針對GnRH受體在文昌魚神經系統、哈氏窩和性腺中的定位和表達進行了研究。結果表明，神經系統中神經細胞、尤其是在中腦右側延伸出與哈氏窩相接觸的漏斗樣結構中的神經細胞、哈氏窩上皮細胞以及雌、雄性腺中生殖細胞都有GnRH受體mRNA雜交信號，信號物質分布于胞質，胞核為陰性。在貝類方面，Clabby等(1996)通過熒光原位雜交技術，將衛星DNA Cg170定位到原位雜交技術及其在水產養殖中的應用牡蠣的兩對染色體的端粒和亞端粒區域，但沒有指明定位的特異染色體，后來王永平等(2O01)將此衛星序列重新定位在長牡蠣染色體的著絲粒處。在整個雙殼貝類甚至在整個貝類中Cgl70可能是第一個定位到牡蠣著絲點區域的衛星序列。此外，還將牡蠣核糖體rDNA定位到長目力的第10對染色體上和美洲牡蠣的第2對染色體上(wang et al．2000、2001)。在斧蛤，報道了一個以160 bp為重復單位的衛星DNA家族，這個家族的脊椎動物端粒序列已經被定位到所有染色體的端粒區域(Plohl et a1．1997)，在貽貝報道了一個以173 bp為重復單位的衛星序列，約占基因組的0.6% (Ruiz et a1．1992)。李 奎等(1995)用地高辛標記原位雜交技術將黃膳的rRNA基因定位于二價染色體的3q12-q14和7q14-q26位置上。

　　3.2 性別鑒定

　　性別控制對加快選種進程，提高經濟效益有著非常重要的作用。魚類的性別類型多(XX／XY、

　　XX／XO、ZW／ZZ、ZO／ZZ)性別鑒定系統比較復雜。Nakayama等(1994)通過消減克隆的方法對兔脂鯉魚的基因組DNA進行了檢測，從10個插入克隆中發現兩個克隆存在性別特異性的模式。通過原位雜交發現，在24個個體中有21個個體具有與其性別相符合的染色體特征和雜交模式，1個雌魚具有雄魚的特征，兩個雄魚具有雌魚的染色體特征和雜交模式，這3個非典型個體可能是由于Z染色體和w染色體區域間的基因交換造成的。Iturra等(1998)以900 bp的探針結合RAPD分析確定了虹鱒的性染色體分子標記，發現在一個形態上似Y染色體的染色體上具有一個明顯的RAPD信號，這一發現對于這一種類的性別決定具有重大的意義。

　　3．3 病毒檢測及診斷

　　原位雜交技術是分子生物學與組織化學相結合的一種技術，它從細胞水平上在原位研究特異核酸的分布、數量以及細胞分化、生理、病理狀態、形態特征演化之間的關系(呂玲等2000)。由于原位雜交能在成分復雜的組織中進行單一細胞的研究而不受同一組織中其他成分的影響，而且不需要從組織中提取核酸，而對于組織中含量極低的外源染色體片段有極高的敏感性，因此，此技術自1993年以來廣泛應用于對蝦病毒的檢測以及對蝦病毒病的診斷。較早的是Bruce等(1994)利用此技術檢測感染桿狀病毒(BP)的對蝦的各種器官。在國內，雷質文等(2001、2002)用PCR法制備地高辛標記的探針，采用原位雜交技術對中國對蝦和克氏原鰲蝦體內的白斑綜合征病毒(WSSV)進行了檢測。結果表明，此技術在對蝦暴發性流行病的診斷方面具有很高的應用價值。呂玲等(2000)采用原位雜交對對蝦的白斑綜合征病毒的組織特異性進行了檢測，所得到的陽性細胞個數比HE多，而且探針的敏感性隨探針長度的增加而降低。鄧敏等(2000)運用建立的WSSV部分基因組文庫，將WSSV EcoR I克隆片段標記制備為探針，進行原位雜交，其結果證明了克隆片段對WSSV的特異性，并為檢測WSSV提供了方法。

　　3.4 其他方面的應用

　　原位雜交技術除了在上述方面的應用之外，在檢測藥物耐藥性方面也得到了應用。楊漢春等(2001)、趙靜等(1999)以隨機引物法，用地高辛標記制備成探針，成功建立了菌落原位雜交法用于檢測豬源大腸桿菌和豬源大腸埃希氏菌對卡那霉素和四環素抗藥性的研究，結果表明與藥敏試驗的陽性符合率分別為100％和91.7%。

　　4 展望

　　綜上所述，原位雜交技術因其高度的靈敏性和準確性而日益受到許多科研工作者的歡迎，并廣泛應用到基因定位、性別鑒定和基因圖譜的構建等研究領域。目前原位雜交技術在植物中的應用比較廣泛，例如在棉花、麥類和樹木等的遺傳育種方面取得了顯著的成就，在畜牧上原位雜交技術主要用于基因定位和基因圖譜的構建以及轉基因的檢測和性別鑒定等方面。在水產方面，原位雜交技術則主要應用于基因定位(多見于對魚類和貝類等水生物的研究)和病毒的檢測(多見于蝦類)。此外，原位雜交技術做為染色體高分辨顯帶技術的補充和發展，在水生物的細胞遺傳學的研究領域將發揮更重要的作用。同其他的生物技術一樣，原位雜交技術在其發展與應用的過程中會出現一些問題，但隨著原位雜交技術的不斷改進與完善以及檢測手段的改進，原位雜交技術的優越性越來越突出，其應用也會更加廣泛。