A.1  適用范圍

本方法適用于測定水產品肌肉組織中氯霉素的殘留量。

A.2  原理

利用抗體抗原反應。微孔板包被有針對兔免疫球蛋白（IgG）（氯霉素抗體）的羊抗體，加入氯霉素抗體、氯霉素標記物、標準和樣品溶液。游離氯霉素與氯霉素酶標記物競爭氯霉素抗體，同時氯霉素抗體與羊抗體連接。沒有連接的酶標記物在洗滌步驟中被洗去。將酶基質（過氧化尿素）和發色劑（四甲基聯苯胺）加入到孔中并孵育；結合的酶標記物將無色的發色劑轉化成藍色的產物。加入反應停止液后使顏色由藍變為黃，在450 nm處測量，吸光度與樣品的氯霉素濃度成反比。

A.3  檢測限

篩選方法的檢測下限為1mg/kg。

A.4  儀器

A.4.1  離心機。

A.4.2  微孔酶標儀（450 nm）。

A.4.3  旋轉蒸發儀。

A.4.4  混合器。

A.4.5  移液器。

A.4.6  50mL，100mL，450mL微量加液器等。

A.5  藥品和試劑

除非另有說明，在分析中僅使用確認為分析純的試劑和蒸餾水或去離子水或相當純度的水。

A.5.1  乙酸乙酯。

A.5.2  乙腈。

A.5.3  正己烷。

A.5.4  磷酸鹽緩沖液（PBS）（pH7.2）：0.55 g磷酸二氫鈉（NaH2PO4·H2O），2.85 g磷酸氫二鈉（Na2HPO4·2H2O），9 g氯化鈉（NaCl）加入蒸餾水至1 000 mL。

A.6  標準溶液

分別取標準濃縮液50 mL用450 mL緩沖液1（試劑盒提供）稀釋并混均勻，制成0、50ng/L、50 ng/L、450 ng/L、1 350 ng/L、4 050 ng/L的標準溶液。

A.7  樣品提取和純化

A.7.1  取5.0 g粉碎的魚肉樣品（樣品先去脂肪組織），與20 mL乙腈水溶液（86+16）混合10 min,15℃離心10 min（4 000r/min）。

A.7.2  取3 mL上清液與3 mL蒸餾水混合，加入4.5 mL乙酸乙酯混合10 min，15℃離心10 min（4 000r/min）。

A.7.3  將乙酸乙酯層轉移至另一瓶中繼續干燥，用1.5 mL緩沖液1溶液干燥的殘留物，加入1.5 mL正己烷混合。

A.7.4  完全除去正己烷層（上層），取50mL水箱進行分析。

A.8  樣品測定程序

A.8.1  將足夠標準和樣品所用數量的孔條插入微孔架，記錄下標準和樣品的位置，每一樣品和標準做兩個平行實驗。

A.8.2  加入50mL稀釋了的酶標記物到微孔底部，再加入50mL的標準或處理好的樣品液到各自的微孔中。

A.8.3  加入50mL稀釋了的抗體溶液到每一個微孔底部充分混合，在室溫孵育2 h。

A.8.4  倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打（每行拍打3次）以保證完全除去孔中的液體，然后用250mL蒸餾水充入孔中，再次倒掉微孔中的液體，再重復操作兩次。

A.8.5  加入50mL基質、50mL發色試劑到微孔中，充分混合并在室溫、暗處孵育30 min。

A.8.6  加入100mL反應停止液到微孔中，混合好，以空氣為空白，在450 nm處測量吸光度值（注意：必須在加入反應停止液后60 min內讀取吸光度值）。

A.9  結果

所獲得的標準和樣品吸光度值的平均值除以第一個標準（0標準）的吸光度值再乘以100，得到以百分比給出的吸光度值，以式（A.1）表示：

                                                  ·············· （A.1）

式中：

E——吸光度值，%；

A——標準或樣品的吸光度值；

A0——0標準的吸光度值。