……（A.1）
式中：
E——吸光度值，%；
A——標準或樣品的吸光度值；
A0——0標準的吸光度值。
以計算的標準值繪成一個對應氯霉素濃度（ng/L）的半對數坐標系統曲線圖，校正的曲線在50 ng/L～1 350 ng/L的范圍內應成為線性，相對應的每一個樣品的濃度，可以從曲線上讀出。乘出稀釋倍數即可得到樣品中氯霉素的實際濃度（ng/kg）。
 
附 錄 B
（規范性附錄）
己烯雌酚（DES）殘留的酶聯免疫測定法
B.1 適用范圍
本方法適用于測定水產品肌肉等可食組織中己烯雌酚的殘留量。
B.2 原理
測定的基礎是利用抗體抗原反應。微孔板包被有針對兔IgG（DES抗體）的羊抗體，加入DES抗、標準和樣品溶液。DES與DES抗體連接，同時DES抗體與羊抗體連接。洗滌步驟后，加入DES酶標記物，DES酶標記物與孔中未結合的DES抗體結合，然后在洗滌步驟中除去未結合的DES酶標記物。將酶基質和發色劑（四甲基聯苯胺）加入到孔中并孵育；結合的酶標記物將無色的發色劑轉化為藍色的產物。加入反應停止液后使顏色由藍變為黃，在450 nm處沒量，吸光度與樣品的己烯雌酚濃度成反比。
B.3 檢測限
己烯雌酚檢測的下限為1mg/kg。
B.4 儀器
B.4.1 微孔酶標儀（450 nm）。
B.4.2 離心機。
B.4.3 37℃恒溫箱。
B.4.4 移液器。
B.4.5 50mL，100mL，450mL微量加液器。
B.4.6 RIDA C18柱等。
B.5 試劑和標準溶液
除非另有說明，在分析中僅使用確認為分析純的試劑和蒸餾水或去離子水或相當純度的水。
B.5.1 叔丁基甲基醚。
B.5.2 石油醚。
B.5.3 二氯甲烷。
B.5.4 6 mol/L磷酸。
B.5.5 乙酸鈉緩沖液等。
B.5.6 提供的DES標準液為直接使用液，濃度為0、12.5×10–9mol/L、25×10–9mol/L、50×10–9mol/L、100×10–9mol/L、200×10–9mol/L。
B.6 樣品處理
B.6.1 取5.0 g肌肉（除去脂肪組織），用10 mL pH為7.2的67 m mol/L磷酸緩沖液研磨后，用8 mL叔丁基甲基醚提取研磨物，強烈振蕩20 min；離心10 min（4 000 r/min）；移去上清液，用8 mL叔丁基甲基醚重復提取沉淀物。
B.6.2 將兩次提取的醚相合并，并且蒸發；用1 mL甲醇（70%）溶解干燥的殘留物；用3 mL石油醚洗滌甲醇溶液（研磨15 s，短時間離心，吸除石油醚）。
B.6.3 蒸發甲醇溶液，用1 mL二氯甲烷溶解后，再用3 mL 1 mol/L的氫氧化鈉（NaOH）溶液提取；然后300 mL 6 mol/L磷酸中和提取液，用RIDA C18柱進行純化。
B.7 測定程序（室溫20℃～24℃條件下操作）
B.7.1 將足夠標準和樣品所用數量的孔條插入微孔架，標準和樣品做兩個平行實驗，記錄下標準和樣品的位置。
B.7.2 加入20mL的標準和處理好的樣品到各自的微孔中，標準和樣品做兩個平行實驗。
B.7.3 加入50mL稀釋后的DES抗體到每一個微孔中，充分混合并在2℃～8℃孵育過夜（注意：在第二早上繼續進行實驗之前，微孔板應在室溫下放置30 min以上，稀釋用緩沖液也應回到室溫，因此最好將緩沖液放在室溫下過夜）。
B.7.4 倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打（每行拍打3次）以保證完全除去孔中的液體，用250mL蒸餾水充入孔中，再次倒掉微孔中液體，再重復操作兩次。
B.7.5 加入5mL稀釋的酶標記物到微孔底部，室溫孵育1 h。
B.7.6 倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打（每次拍打3次）以保證完全除去孔中的液體，用250mL蒸餾水充入孔中，再次倒掉微孔中液體，再重復操作一次。
B.7.7 加入50mL基質和50mL發色試劑到微孔中，充分混合并在室溫暗處孵育15 min。
B.7.8 加入100mL反應停止液到微孔中，混合好在450 nm處測量吸光度值（可選擇＞600nm的參比濾光片），以空氣為空白，必須在加入停止液后60 min內讀取吸光度值。
B.8 結果
所獲得的標準和樣品吸光度值的平均值除以第一個標準（0標準）的吸光度值再乘以100，得到以百分比給出的吸光度值，以式（B.1）表示：
……（B.1）
式中：
E——吸光度值，%；
A——標準或樣品的吸光度值；
A0——0標準的吸光度值。
以計算的標準值繪成一個對應DES濃度（ng/L）的半對數坐標系統曲線圖，校正的曲線在25 ng/L～200 ng/L的范圍內應成為線性，相對應的每一個樣品的濃度，可以從曲線上讀出。乘以稀釋倍數即可得到樣品中DES的實際濃度（ng/kg）。